Modern genetic approaches are powerful in providing access to diverse cell types in the brain and facilitating the study of their function. Here, we report a large set of driver and reporter transgenic mouse lines, including 23 new driver lines targeting a variety of cortical and subcortical cell populations and 26 new reporter lines expressing an array of molecular tools. In particular, we describe the TIGRE2.0 transgenic platform and introduce Cre-dependent reporter lines that enable optical physiology, optogenetics, and sparse labeling of genetically defined cell populations. TIGRE2.0 reporters broke the barrier in transgene expression level of single-copy targeted-insertion transgenesis in a wide range of neuronal types, along with additional advantage of a simplified breeding strategy compared to our first-generation TIGRE lines. These novel transgenic lines greatly expand the repertoire of high-precision genetic tools available to effectively identify, monitor, and manipulate distinct cell types in the mouse brain.

It is becoming increasingly clear that single cortical neurons encode complex and behaviorally relevant signals, but efficient means to study gene functions in small networks and single neurons in vivo are still lacking. Here, we establish a method for genetic manipulation and subsequent phenotypic analysis of individual cortical neurons in vivo. First, lentiviral vectors are used for neuron-specific gene delivery from alpha-calcium/calmodulin-dependent protein kinase II or Synapsin I promoters, optionally in combination with gene knockdown by means of U6 promoter-driven expression of short-interfering RNAs. Second, the phenotypic analysis at the level of single cortical cells is carried out by using two-photon microscopy-based techniques: high-resolution two-photon time-lapse imaging is used to monitor structural dynamics of dendritic spines and axonal projections, whereas cellular response properties are analyzed electrophysiologically by two-photon microscopy directed whole-cell recordings. This approach is ideally suited for analysis of gene functions in individual neurons in the intact brain.

To understand how the brain processes sensory information to guide behavior, we must know how stimulus representations are transformed throughout the visual cortex. Here we report an open, large-scale physiological survey of activity in the awake mouse visual cortex: the Allen Brain Observatory Visual Coding dataset. This publicly available dataset includes the cortical activity of nearly 60,000 neurons from six visual areas, four layers, and 12 transgenic mouse lines in a total of 243 adult mice, in response to a systematic set of visual stimuli. We classify neurons on the basis of joint reliabilities to multiple stimuli and validate this functional classification with models of visual responses. While most classes are characterized by responses to specific subsets of the stimuli, the largest class is not reliably responsive to any of the stimuli and becomes progressively larger in higher visual areas. These classes reveal a functional organization wherein putative dorsal areas show specialization for visual motion signals. By comparing neural responses to diverse visual stimuli measured with a standardized two-photon imaging pipeline, the authors reveal response specializations within the mouse visual cortex.

Transgenic mouse lines are invaluable tools for neuroscience but, as with any technique, care must be taken to ensure that the tool itself does not unduly affect the system under study. Here we report aberrant electrical activity, similar to interictal spikes, and accompanying fluorescence events in some genotypes of transgenic mice expressing GCaMP6 genetically encoded calcium sensors. These epileptiform events have been observed particularly, but not exclusively, in mice with Emx1-Cre and Ai93 transgenes, of either sex, across multiple laboratories. The events occur at >0.1 Hz, are very large in amplitude (>1.0 mV local field potentials, >10% df/f widefield imaging signals), and typically cover large regions of cortex. Many properties of neuronal responses and behavior seem normal despite these events, although rare subjects exhibit overt generalized seizures. The underlying mechanisms of this phenomenon remain unclear, but we speculate about possible causes on the basis of diverse observations. We encourage researchers to be aware of these activity patterns while interpreting neuronal recordings from affected mouse lines and when considering which lines to study.

Visual perception and behavior are mediated by cortical areas that have been distinguished using architectonic and retinotopic criteria. We employed fluorescence imaging and GCaMP6 reporter mice to generate retinotopic maps, revealing additional regions of retinotopic organization that extend into barrel and retrosplenial cortices. Aligning retinotopic maps to architectonic borders, we found a mismatch in border location, indicating that architectonic borders are not aligned with the retinotopic transition at the vertical meridian. We also assessed the representation of visual space within each region, finding that four visual areas bordering V1 (LM, P, PM and RL) display complementary representations, with overlap primarily at the central hemifield. Our results extend our understanding of the organization of mouse cortex to include up to 16 distinct retinotopically organized regions.

The mammalian brain consists of millions to billions of cells that are organized into many cell types with specific spatial distribution patterns and structural and functional properties1-3. Here we report a comprehensive and high-resolution transcriptomic and spatial cell-type atlas for the whole adult mouse brain. The cell-type atlas was created by combining a single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) dataset of around 7 million cells profiled (approximately 4.0 million cells passing quality control), and a spatial transcriptomic dataset of approximately 4.3 million cells using multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH). The atlas is hierarchically organized into 4 nested levels of classification: 34 classes, 338 subclasses, 1,201 supertypes and 5,322 clusters. We present an online platform, Allen Brain Cell Atlas, to visualize the mouse whole-brain cell-type atlas along with the single-cell RNA-sequencing and MERFISH datasets. We systematically analysed the neuronal and non-neuronal cell types across the brain and identified a high degree of correspondence between transcriptomic identity and spatial specificity for each cell type. The results reveal unique features of cell-type organization in different brain regions-in particular, a dichotomy between the dorsal and ventral parts of the brain. The dorsal part contains relatively fewer yet highly divergent neuronal types, whereas the ventral part contains more numerous neuronal types that are more closely related to each other. Our study also uncovered extraordinary diversity and heterogeneity in neurotransmitter and neuropeptide expression and co-expression patterns in different cell types. Finally, we found that transcription factors are major determinants of cell-type classification and identified a combinatorial transcription factor code that defines cell types across all parts of the brain. The whole mouse brain transcriptomic and spatial cell-type atlas establishes a benchmark reference atlas and a foundational resource for integrative investigations of cellular and circuit function, development and evolution of the mammalian brain.

Abstract Human cortical interneurons have been challenging to study due to high diversity and lack of mature brain tissue platforms and genetic targeting tools. We employed rapid GABAergic neuron viral labeling plus unbiased Patch-seq sampling in brain slices to define the signature morpho-electric properties of GABAergic neurons in the human neocortex. Viral targeting greatly facilitated sampling of the SST subclass, including primate specialized double bouquet cells which mapped to two SST transcriptomic types. Multimodal analysis uncovered an SST neuron type with properties inconsistent with original subclass assignment; we instead propose reclassification into PVALB subclass. Our findings provide novel insights about functional properties of human cortical GABAergic neuron subclasses and types and highlight the essential role of multimodal annotation for refinement of emerging transcriptomic cell type taxonomies. One Sentence Summary Viral genetic labeling of GABAergic neurons in human ex vivo brain slices paired with Patch-seq recording yields an in-depth functional annotation of human cortical interneuron subclasses and types and highlights the essential role of multimodal functional annotation for refinement of emerging transcriptomic cell type taxonomies.

Abstract Neocortical layer 1 (L1) is a site of convergence between pyramidal neuron dendrites and feedback axons where local inhibitory signaling can profoundly shape cortical processing. Evolutionary expansion of human neocortex is marked by distinctive pyramidal neuron types with extensive branching in L1, but whether L1 interneurons are similarly diverse is underexplored. Using patch-seq recordings from human neurosurgically resected tissues, we identified four transcriptomically defined subclasses, unique subtypes within those subclasses and additional types with no mouse L1 homologue. Compared with mouse, human subclasses were more strongly distinct from each other across all modalities. Accompanied by higher neuron density and more variable cell sizes compared with mouse, these findings suggest L1 is an evolutionary hotspot, reflecting the increasing demands of regulating the expanding human neocortical circuit. One Sentence Summary Using transcriptomics and morpho-electric analyses, we describe innovations in human neocortical layer 1 interneurons.

ABSTRACT Neurophysiology studies require the use of inclusion criteria to identify neurons responsive to the experimental stimuli. Five recent studies used calcium imaging to measure the preferred tuning properties of layer 2/3 pyramidal neurons in mouse visual areas. These five studies employed different inclusion criteria and report different, sometimes conflicting results. Here, we examine how different inclusion criteria can impact reported tuning properties, modifying inclusion criteria to select different sub-populations from the same dataset of almost 10,000 layer 2/3 neurons from the Allen Brain Observatory. The choice of inclusion criteria greatly affected the mean tuning properties of the resulting sub-populations; indeed, the differences in mean tuning due to inclusion criteria were often of comparable magnitude to the differences between studies. In particular, the mean preferred temporal frequencies of visual areas changed markedly with inclusion criteria, such that the rank ordering of visual areas based on their temporal frequency preferences changed with the percentage of neurons included. It has been suggested that differences in temporal frequency tuning support a hierarchy of mouse visual areas. These results demonstrate that our understanding of the functional organization of the mouse visual cortex obtained from previous experiments critically depends on the inclusion criteria used.

Location-sensitive and motion-sensitive units are the two major functional types of feedforward projections from lateral genicular nucleus (LGN) to primary visual cortex (V1) in mouse. The distribution of these inputs in cortical depth remains under debate. By measuring the calcium activities of LGN axons in V1 of awake mice, we systematically mapped their functional and structural properties. Although both types distributed evenly across cortical depth, we found that they differ significantly across multiple modalities. Compared to the location-sensitive axons, which possessed confined spatial receptive fields, the motion-sensitive axons lacked spatial receptive fields, preferred lower temporal, higher spatial frequencies and had wider horizontal bouton spread. Furthermore, the motion-sensitive axons showed a strong depth-dependent motion direction bias while the location-sensitive axons showed a depth-independent OFF dominance. Overall, our results suggest a new model of receptive biases and laminar structure of thalamic inputs to V1.