A key aspect of nearly all single-cell sequencing experiments is dissociation of intact tissues into single-cell suspensions. While many protocols have been optimized for optimal cell yield, they have often overlooked the effects that dissociation can have on ex vivo gene expression. Here, we demonstrate that use of enzymatic dissociation on brain tissue induces an aberrant ex vivo gene expression signature, most prominently in microglia, which is prevalent in published literature and can substantially confound downstream analyses. To address this issue, we present a rigorously validated protocol that preserves both in vivo transcriptional profiles and cell-type diversity and yield across tissue types and species. We also identify a similar signature in postmortem human brain single-nucleus RNA-sequencing datasets, and show that this signature is induced in freshly isolated human tissue by exposure to elevated temperatures ex vivo. Together, our results provide a methodological solution for preventing artifactual gene expression changes during fresh tissue digestion and a reference for future deeper analysis of the potential confounding states present in postmortem human samples.

The cerebellum is a well-studied brain structure with diverse roles in motor learning, coordination, cognition, and autonomic regulation. Nonetheless, a complete inventory of cerebellar cell types is presently lacking. We used high-throughput transcriptional profiling to molecularly define cell types across individual lobules of the adult mouse cerebellum. Purkinje and granule neurons showed considerable regional specialization, with the greatest diversity occurring in the posterior lobules. For multiple types of cerebellar interneurons, the molecular variation within each type was more continuous, rather than discrete. For the unipolar brush cells (UBCs)—an interneuron population previously subdivided into two discrete populations—the continuous variation in gene expression was associated with a graded continuum of electrophysiological properties. Most surprisingly, we found that molecular layer interneurons (MLIs) were composed of two molecularly and functionally distinct types. Both show a continuum of morphological variation through the thickness of the molecular layer, but electrophysiological recordings revealed marked differences between the two types in spontaneous firing, excitability, and electrical coupling. Together, these findings provide the first comprehensive cellular atlas of the cerebellar cortex, and outline a methodological and conceptual framework for the integration of molecular, morphological, and physiological ontologies for defining brain cell types.

Abstract Single cell transcriptomics has transformed the characterization of brain cell identity by providing quantitative molecular signatures for large, unbiased samples of brain cell populations. With the proliferation of taxonomies based on individual datasets, a major challenge is to integrate and validate results toward defining biologically meaningful cell types. We used a battery of single-cell transcriptome and epigenome measurements generated by the BRAIN Initiative Cell Census Network (BICCN) to comprehensively assess the molecular signatures of cell types in the mouse primary motor cortex (MOp). We further developed computational and statistical methods to integrate these multimodal data and quantitatively validate the reproducibility of the cell types. The reference atlas, based on more than 600,000 high quality single-cell or -nucleus samples assayed by six molecular modalities, is a comprehensive molecular account of the diverse neuronal and non-neuronal cell types in MOp. Collectively, our study indicates that the mouse primary motor cortex contains over 55 neuronal cell types that are highly replicable across analysis methods, sequencing technologies, and modalities. We find many concordant multimodal markers for each cell type, as well as thousands of genes and gene regulatory elements with discrepant transcriptomic and epigenomic signatures. These data highlight the complex molecular regulation of brain cell types and will directly enable design of reagents to target specific MOp cell types for functional analysis.

Charting a biological atlas of an organ, such as the brain, requires us to spatially-resolve whole transcriptomes of single cells, and to relate such cellular features to the histological and anatomical scales. Single-cell and single-nucleus RNA-Seq (sc/snRNA-seq) can map cells comprehensively 5,6 , but relating those to their histological and anatomical positions in the context of an organ’s common coordinate framework remains a major challenge and barrier to the construction of a cell atlas 7–10 . Conversely, Spatial Transcriptomics allows for in-situ measurements 11–13 at the histological level, but at lower spatial resolution and with limited sensitivity. Targeted in situ technologies 1–3 solve both issues, but are limited in gene throughput which impedes profiling of the entire transcriptome. Finally, as samples are collected for profiling, their registration to anatomical atlases often require human supervision, which is a major obstacle to build pipelines at scale. Here, we demonstrate spatial mapping of cells, histology, and anatomy in the somatomotor area and the visual area of the healthy adult mouse brain. We devise Tangram, a method that aligns snRNA-seq data to various forms of spatial data collected from the same brain region, including MERFISH 1 , STARmap 2 , smFISH 3 , and Spatial Transcriptomics 4 (Visium), as well as histological images and public atlases. Tangram can map any type of sc/snRNA-seq data, including multi-modal data such as SHARE-seq data 5 , which we used to reveal spatial patterns of chromatin accessibility. We equipped Tangram with a deep learning computer vision pipeline, which allows for automatic identification of anatomical annotations on histological images of mouse brain. By doing so, Tangram reconstructs a genome-wide, anatomically-integrated, spatial map of the visual and somatomotor area with ∼30,000 genes at single-cell resolution, revealing spatial gene expression and chromatin accessibility patterning beyond current limitation of in-situ technologies.

The function of the mammalian brain relies upon the specification and spatial positioning of diversely specialized cell types. Yet, the molecular identities of the cell types and their positions within individual anatomical structures remain incompletely known. To construct a comprehensive atlas of cell types in each brain structure, we paired high-throughput single-nucleus RNA sequencing with Slide-seq1,2-a recently developed spatial transcriptomics method with near-cellular resolution-across the entire mouse brain. Integration of these datasets revealed the cell type composition of each neuroanatomical structure. Cell type diversity was found to be remarkably high in the midbrain, hindbrain and hypothalamus, with most clusters requiring a combination of at least three discrete gene expression markers to uniquely define them. Using these data, we developed a framework for genetically accessing each cell type, comprehensively characterized neuropeptide and neurotransmitter signalling, elucidated region-specific specializations in activity-regulated gene expression and ascertained the heritability enrichment of neurological and psychiatric phenotypes. These data, available as an online resource ( www.BrainCellData.org ), should find diverse applications across neuroscience, including the construction of new genetic tools and the prioritization of specific cell types and circuits in the study of brain diseases.

ABSTRACT We report the generation of a multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex (MOp or M1) as the initial product of the BRAIN Initiative Cell Census Network (BICCN). This was achieved by coordinated large-scale analyses of single-cell transcriptomes, chromatin accessibility, DNA methylomes, spatially resolved single-cell transcriptomes, morphological and electrophysiological properties, and cellular resolution input-output mapping, integrated through cross-modal computational analysis. Together, our results advance the collective knowledge and understanding of brain cell type organization: First, our study reveals a unified molecular genetic landscape of cortical cell types that congruently integrates their transcriptome, open chromatin and DNA methylation maps. Second, cross-species analysis achieves a unified taxonomy of transcriptomic types and their hierarchical organization that are conserved from mouse to marmoset and human. Third, cross-modal analysis provides compelling evidence for the epigenomic, transcriptomic, and gene regulatory basis of neuronal phenotypes such as their physiological and anatomical properties, demonstrating the biological validity and genomic underpinning of neuron types and subtypes. Fourth, in situ single-cell transcriptomics provides a spatially-resolved cell type atlas of the motor cortex. Fifth, integrated transcriptomic, epigenomic and anatomical analyses reveal the correspondence between neural circuits and transcriptomic cell types. We further present an extensive genetic toolset for targeting and fate mapping glutamatergic projection neuron types toward linking their developmental trajectory to their circuit function. Together, our results establish a unified and mechanistic framework of neuronal cell type organization that integrates multi-layered molecular genetic and spatial information with multi-faceted phenotypic properties.

Summary MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs involved in post-transcriptional gene regulation that have a major impact on many diseases and provides an exciting avenue towards antiviral therapeutics. From patient transcriptomic data, we have discovered a circulating miRNA, miR-2392, that is directly involved with SARS-CoV-2 machinery during host infection. Specifically, we show that miR-2392 is key in driving downstream suppression of mitochondrial gene expression, increasing inflammation, glycolysis, and hypoxia as well as promoting many symptoms associated with COVID-19 infection. We demonstrate miR-2392 is present in the blood and urine of COVID-19 positive patients, but not detected in COVID-19 negative patients. These findings indicate the potential for developing a novel, minimally invasive, COVID-19 detection method. Lastly, using in vitro human and in vivo hamster models, we have developed a novel miRNA-based antiviral therapeutic that targets miR-2392, significantly reduces SARS-CoV-2 viability in hamsters and may potentially inhibit a COVID-19 disease state in humans.

Abstract Midbrain dopamine (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) project widely throughout the central nervous system, playing critical roles in voluntary movements, reward processing, and working memory. Many of these neurons are highly sensitive to neurodegeneration in Parkinson’s Disease (PD), and their loss correlates strongly with the pathognomonic symptoms. To characterize these populations molecularly, we developed a protocol to enrich and transcriptionally profile DA neuron nuclei from postmortem human SNpc of both PD patients and matched controls. We identified a total of ten distinct populations, including one that was primate-specific. A single subtype, marked by the gene AGTR1 , was highly susceptible to degeneration, and was enriched for expression of genes associated with PD in genetic studies, suggesting many risk loci act within this subtype to influence its neurodegeneration. The AGTR1 subtype also showed the strongest upregulation of TP53 and its downstream targets, nominating a potential pathway of degeneration in vivo . The transcriptional characterization of differentially disease-vulnerable DA neurons in the SNpc will inform the development of laboratory models, enable the nomination of novel disease biomarkers, and guide further studies of pathogenic disease mechanisms.

Abstract In addition to its well-known contributions to motor function, the cerebellum is involved in emotional regulation, anxiety, and affect 1-4 . We found that suppressing the firing of cerebellar Purkinje cells (PCs) rapidly excites forebrain areas that could contribute to such functions (including the amygdala, basal forebrain, and septum), but that the classic cerebellar outputs, the deep cerebellar nuclei (DCN), do not project to these forebrain regions. Here we show that PCs directly inhibit parabrachial nuclei (PBN) neurons that project to and influence numerous forebrain regions in a manner distinct from the DCN pathway. We also found that the PBN and DCN output pathways differentially influence behavior: suppressing the PC to PBN pathway is aversive and does not affect the speed of movement, whereas suppressing the PC to DCN pathway is not aversive and reduces speed. Molecular profiling shows that PCs inhibit numerous types of PBN neurons that control diverse nonmotor behaviors 5-9 . Therefore, the PBN pathway allows the cerebellum to regulate activity in many forebrain regions and may be an important substrate for nonmotor disorders related to cerebellar dysfunction.

Abstract Recent technological innovations have enabled the high-throughput quantification of gene expression and epigenetic regulation within individual cells, transforming our understanding of how complex tissues are constructed. Missing from these measurements, however, is the ability to routinely and easily spatially localise these profiled cells. We developed a strategy, Slide-tags, in which single nuclei within an intact tissue section are ‘tagged’ with spatial barcode oligonucleotides derived from DNA-barcoded beads with known positions. These tagged nuclei can then be used as input into a wide variety of single-nucleus profiling assays. Application of Slide-tags to the mouse hippocampus positioned nuclei at less than 10 micron spatial resolution, and delivered whole-transcriptome data that was indistinguishable in quality from ordinary snRNA-seq. To demonstrate that Slide-tags can be applied to a wide variety of human tissues, we performed the assay on brain, tonsil, and melanoma. We revealed cell-type-specific spatially varying gene expression across cortical layers and spatially contextualised receptor-ligand interactions driving B-cell maturation in lymphoid tissue. A major benefit of Slide-tags is that it is easily adaptable to virtually any single-cell measurement technology. As proof of principle, we performed multiomic measurements of open chromatin, RNA, and T-cell receptor sequences in the same cells from metastatic melanoma. We identified spatially distinct tumour subpopulations to be differentially infiltrated by an expanded T-cell clone and undergoing cell state transition driven by spatially clustered accessible transcription factor motifs. Slide-tags offers a universal platform for importing the compendium of established single-cell measurements into the spatial genomics repertoire.