Generative artificial intelligence (AI) has the potential to greatly increase the speed, quality and controllability of antibody design. Traditional de novo antibody discovery requires time and resource intensive screening of large immune or synthetic libraries. These methods also offer little control over the output sequences, which can result in lead candidates with sub-optimal binding and poor developability attributes. Several groups have introduced models for generative antibody design with promising in silico evidence, however, no such method has demonstrated de novo antibody design with experimental validation. Here we use generative deep learning models to de novo design antibodies against three distinct targets, in a zero-shot fashion, where all designs are the result of a single round of model generations with no follow-up optimization. In particular, we screen over 400,000 antibody variants designed for binding to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) using our high-throughput wet lab capabilities. From these screens, we further characterize 421 binders using surface plasmon resonance (SPR), finding three that bind tighter than the therapeutic antibody trastuzumab. The binders are highly diverse, have low sequence identity to known antibodies, and adopt variable structural conformations. Additionally, these binders score highly on our previously introduced Naturalness metric, indicating they are likely to possess desirable developability profiles and low immunogenicity. We open source the HER2 binders and report the measured binding affinities. These results unlock a path to accelerated drug creation for novel therapeutic targets using generative AI combined with high-throughput experimentation.

Deep learning approaches have demonstrated the ability to design protein sequences given backbone structures [1, 2, 3, 4, 5]. While these approaches have been applied in silico to designing antibody complementarity-determining regions (CDRs), they have yet to be validated in vitro for designing antibody binders, which is the true measure of success for antibody design. Here we describe IgDesign, a deep learning method for antibody CDR design, and demonstrate its robustness with successful binder design for 8 therapeutic antigens. The model is tasked with designing heavy chain CDR3 (HCDR3) or all three heavy chain CDRs (HCDR123) using native backbone structures of antibody-antigen complexes, along with the antigen and antibody framework (FWR) sequences as context. For each of the 8 antigens, we design 100 HCDR3s and 100 HCDR123s, scaffold them into the native antibody9s variable region, and screen them for binding against the antigen using surface plasmon resonance (SPR). As a baseline, we screen 100 HCDR3s taken from the model9s training set and paired with the native HCDR1 and HCDR2. We observe that both HCDR3 design and HCDR123 design outperform this HCDR3- only baseline. IgDesign is the first experimentally validated antibody inverse folding model. It can design antibody binders to multiple therapeutic antigens with high success rates and, in some cases, improved affinities over clinically validated reference antibodies. Antibody inverse folding has applications to both de novo antibody design and lead optimization, making IgDesign a valuable tool for accelerating drug development and enabling therapeutic design.

Abstract Management of gastrointestinal stromal tumor (GIST) has been revolutionized by the identification of activating mutations in KIT and PDGFRA, and the clinical application of receptor tyrosine kinase (RTK) inhibitors in the advanced disease setting. Stratification of GIST into molecularly defined subsets provides insight into clinical behavior and response to approved targeted therapies. Although these RTK inhibitors are effective in the majority of GIST, resistance to these agents remains a significant clinical problem. Development of effective treatment strategies for refractory GIST subtypes requires identification of novel targets to provide additional therapeutic options. Global kinome profiling has the potential to identify critical signaling networks and reveal protein kinases that are essential in GIST. Using Multiplexed Inhibitor Beads and Mass Spectrometry, we explored the majority of the kinome in GIST specimens from the three most common molecular subtypes to identify novel kinase targets. Kinome profiling revealed distinct signatures in GIST subtypes and identified kinases that are universally activated in all GIST, as well as kinases that are unique to each subtype. Kinome profiling in combination with loss-of-function assays identified a significant role for the G2-M tyrosine kinase, Wee1, in GIST cell survival. In vitro and in vivo studies revealed significant efficacy of MK-1775 (Wee1 inhibitor) in combination with avapritinib in KIT and PDGFRA -mutant GIST cell lines, and notable efficacy of MK-1775 as a single agent in the PDGFRA -mutant line. These studies provide strong preclinical justification for the use of MK-1775 in GIST.

Abstract Purpose: SDHA mutations are the most common cause of SDH-deficient GIST. Enhanced cancer surveillance of individuals carrying a known pathogenic germline SDHA mutation has the potential to detect early-stage tumors, allowing for improved patient outcomes. However, more than 95% of the > 1,000 SDHA missense variants listed in ClinVar are variants of uncertain significance (VUS). Our ability to interpret the significance of SDHA variants must improve before genetic sequencing can be utilized to its full potential. Experimental Design: SDHA variants were introduced into a clonal SDHA-knockout cell line via Bxb1-mediated recombination. SDH Activity and SDHA abundance were determined for each variant and logistic regression analysis was used to derive functional evidence for clinical variant interpretation. Results: Our analysis revealed that cancer-associated SDHA missense variants can be clearly distinguished from non-cancer variants according to the extent of SDH dysfunction caused. As such, SDH activity data can be used to predict cancer pathogenicity with strong performance metrics, exceeding those of computational prediction tools. From these data, we obtained functional evidence for clinical variant interpretation from 21 of 22 assayed VUS, with 19 in favor of cancer pathogenicity and two against pathogenicity. Lastly, simulating the addition of our functional evidence with limited pre-existing evidence allowed for 18 of 22 variants to be reclassified. Conclusions: We describe a novel pipeline for investigating the functional consequences of SDHA missense variants. In total, we characterized 72 variants, developed criteria for obtaining functional evidence, and demonstrated the potential of this evidence for clinical variant interpretation.