Deep learning generative approaches provide an opportunity to broadly explore protein structure space beyond the sequences and structures of natural proteins. Here, we use deep network hallucination to generate a wide range of symmetric protein homo-oligomers given only a specification of the number of protomers and the protomer length. Crystal structures of seven designs are very similar to the computational models (median root mean square deviation: 0.6 angstroms), as are three cryo-electron microscopy structures of giant 10-nanometer rings with up to 1550 residues and C33 symmetry; all differ considerably from previously solved structures. Our results highlight the rich diversity of new protein structures that can be generated using deep learning and pave the way for the design of increasingly complex components for nanomachines and biomaterials.

Abstract While deep learning has revolutionized protein structure prediction, almost all experimentally characterized de novo protein designs have been generated using physically based approaches such as Rosetta. Here we describe a deep learning based protein sequence design method, ProteinMPNN, with outstanding performance in both in silico and experimental tests. The amino acid sequence at different positions can be coupled between single or multiple chains, enabling application to a wide range of current protein design challenges. On native protein backbones, ProteinMPNN has a sequence recovery of 52.4%, compared to 32.9% for Rosetta. Incorporation of noise during training improves sequence recovery on protein structure models, and produces sequences which more robustly encode their structures as assessed using structure prediction algorithms. We demonstrate the broad utility and high accuracy of ProteinMPNN using X-ray crystallography, cryoEM and functional studies by rescuing previously failed designs, made using Rosetta or AlphaFold, of protein monomers, cyclic homo-oligomers, tetrahedral nanoparticles, and target binding proteins. One-sentence summary A deep learning based protein sequence design method is described that is widely applicable to current design challenges and shows outstanding performance in both in silico and experimental tests.

Many peptide hormones form an α-helix on binding their receptors1-4, and sensitive methods for their detection could contribute to better clinical management of disease5. De novo protein design can now generate binders with high affinity and specificity to structured proteins6,7. However, the design of interactions between proteins and short peptides with helical propensity is an unmet challenge. Here we describe parametric generation and deep learning-based methods for designing proteins to address this challenge. We show that by extending RFdiffusion8 to enable binder design to flexible targets, and to refining input structure models by successive noising and denoising (partial diffusion), picomolar-affinity binders can be generated to helical peptide targets by either refining designs generated with other methods, or completely de novo starting from random noise distributions without any subsequent experimental optimization. The RFdiffusion designs enable the enrichment and subsequent detection of parathyroid hormone and glucagon by mass spectrometry, and the construction of bioluminescence-based protein biosensors. The ability to design binders to conformationally variable targets, and to optimize by partial diffusion both natural and designed proteins, should be broadly useful.

Abstract Despite transformative advances in protein design with deep learning, the design of small-molecule–binding proteins and sensors for arbitrary ligands remains a grand challenge. Here we combine deep learning and physics-based methods to generate a family of proteins with diverse and designable pocket geometries, which we employ to computationally design binders for six chemically and structurally distinct small-molecule targets. Biophysical characterization of the designed binders revealed nanomolar to low micromolar binding affinities and atomic-level design accuracy. The bound ligands are exposed at one edge of the binding pocket, enabling the de novo design of chemically induced dimerization (CID) systems; we take advantage of this to create a biosensor with nanomolar sensitivity for cortisol. Our approach provides a general method to design proteins that bind and sense small molecules for a wide range of analytical, environmental, and biomedical applications.

Summary Protein crystallization plays a central role in structural biology 1 , with broad impact 2 in pharmaceutical formulation 3 , drug delivery 4 , biosensing 5 , and biocatalysis 6,7 . Despite this importance, the process of protein crystallization remains poorly understood and highly empirical 8–10 , with largely unpredictable crystal contacts, lattice packing arrangements, and space group preferences, and the programming of protein crystallization through precisely engineered sidechain-sidechain interactions across multiple protein-protein interfaces is an outstanding challenge. Here we develop a general computational approach to designing three-dimensional (3D) protein crystals with pre-specified lattice architectures at atomic accuracy that hierarchically constrains the overall degree of freedoms (DOFs) of the system. We use the approach to design three pairs of oligomers that can be individually purified, and upon mixing, spontaneously self-assemble into large 3D crystals (>100 μm). Small-angle X-ray scattering and X-ray crystallography show these crystals are nearly identical to the computational design models, with the design target F 4 1 32 and I 432 space groups and closely corresponding overall architectures and protein-protein interfaces. The crystal unit cell dimensions can be systematically redesigned while retaining space group symmetry and overall architecture, and the crystals are both extremely porous and highly stable, enabling the robust scaffolding of inorganic nanoparticle arrays. Our approach thus enables the computational design of protein crystals with high accuracy, and since both structure and assembly are encoded in the primary sequence, provides a powerful new platform for biological material engineering.

Abstract Deep learning generative approaches provide an opportunity to broadly explore protein structure space beyond the sequences and structures of natural proteins. Here we use deep network hallucination to generate a wide range of symmetric protein homo-oligomers given only a specification of the number of protomers and the protomer length. Crystal structures of 7 designs are very close to the computational models (median RMSD: 0.6 Å), as are 3 cryoEM structures of giant rings with up to 1550 residues, C33 symmetry, and 10 nanometer in diameter; all differ considerably from previously solved structures. Our results highlight the rich diversity of new protein structures that can be created using deep learning, and pave the way for the design of increasingly complex nanomachines and biomaterials. One-sentence summary Deep network-based protein design enables the generation of cyclic homo-oligomers across the nanoscopic scale.

Abstract Computationally designed protein nanoparticles have recently emerged as a promising platform for the development of new vaccines and biologics. For many applications, secretion of designed nanoparticles from eukaryotic cells would be advantageous, but in practice they often secrete poorly. Here we show that designed hydrophobic interfaces that drive nanoparticle assembly are often predicted to form cryptic transmembrane domains, suggesting that interaction with the membrane insertion machinery could limit efficient secretion. We develop a general computational protocol, the Degreaser, to design away cryptic transmembrane domains without sacrificing protein stability. Retroactive application of the Degreaser to previously designed nanoparticle components and nanoparticles considerably improves secretion, and modular integration of the Degreaser into design pipelines results in new nanoparticles that secrete as robustly as naturally occurring protein assemblies. Both the Degreaser protocol and the novel nanoparticles we describe may be broadly useful in biotechnological applications.

Abstract Segments of proteins with β-strand propensity can self associate to form amyloid fibrils associated with many diseases. These regions often adopt alternative structures in their folded states, or are intrinsically disordered in solution, making it difficult to generate binders or inhibitors with existing strategies. Here we describe a general approach to bind such segments in β-strand and β-hairpin conformations using de novo designed scaffolds that contain deep peptide binding clefts flanked by β-strands that form hydrogen bonds to the peptide upon binding. The designs bind their cognate peptides in vitro with nanomolar affinities and in mammalian cells. The crystal structure of a designed protein-peptide complex is close to the design model, and NMR characterization reveals how the peptide binding cleft is protected in the apo state. We use the approach to design binders to segments of the amyloid forming proteins Transthyretin, Tau, Serum amyloid A1 and Aβ42. The Aβ binders block assembly of Aβ fibrils as effectively as the most potent of the clinically tested antibodies to date.

Transmembrane β-barrels have considerable potential for a broad range of sensing applications. Current engineering approaches for nanopore sensors are limited to naturally occurring channels, which provide suboptimal starting points. By contrast, de novo protein design can in principle create an unlimited number of new nanopores with any desired properties. Here we describe a general approach to designing transmembrane β-barrel pores with different diameters and pore geometries. Nuclear magnetic resonance and crystallographic characterization show that the designs are stably folded with structures resembling those of the design models. The designs have distinct conductances that correlate with their pore diameter, ranging from 110 picosiemens (~0.5 nanometer pore diameter) to 430 picosiemens (~1.1 nanometer pore diameter). Our approach opens the door to the custom design of transmembrane nanopores for sensing and sequencing applications.

Abstract In pseudocyclic proteins such as TIM barrels, β barrels, and some helical transmembrane channels, a single subunit is repeated in a cyclic pattern, giving rise to a central cavity which can serve as a pocket for ligand binding or enzymatic activity. Inspired by these proteins, we devised a deep learning-based approach to broadly exploring the space of closed repeat proteins starting from only a specification of the repeat number and length. Biophysical data for 38 structurally diverse pseudocyclic designs produced in E. coli are consistent with the design models, and two crystal structures we were able to obtain are very close to the designed structures. Docking studies suggest the diversity of folds and central pockets provide effective starting points for designing small molecule binders or enzymes.