SUMMARY The meninges of the brain are an important component of neuroinflammatory response. Diverse immune cells move from the calvaria marrow into the dura mater via recently discovered skull-meninges connections (SMCs). However, how the calvaria bone marrow is different from the other bones and whether and how it contributes to human diseases remain unknown. Using multi-omics approaches and whole mouse transparency we reveal that bone marrow cells are highly heterogeneous across the mouse body. The calvaria harbors the most distinct molecular signature with hundreds of differentially expressed genes and proteins. Acute brain injury induces skull-specific alterations including increased calvaria cell numbers. Moreover, TSPO-positron-emission-tomography imaging of stroke, multiple sclerosis and neurodegenerative disease patients demonstrate disease-associated uptake patterns in the human skull, mirroring the underlying brain inflammation. Our study indicates that the calvaria is more than a physical barrier, and its immune cells may present new ways to control brain pathologies. Graphical Abstract Highlights Bone marrow across the mouse body display heterogeneity in their molecular profile Calvaria cells have a distinct profile that is relevant to brain pathologies Brain native proteins are identified in calvaria in pathological states TSPO-PET imaging of the human skull can be a proxy of neuroinflammation in the brain Supplementary Videos can be seen at: http://discotechnologies.org/Calvaria/

SUMMARY Lipid droplets (LDs) are organelles of cellular lipid storage with fundamental roles in energy metabolism and cell membrane homeostasis. There has been an explosion of research into the biology of LDs, in part due to their relevance in diseases of lipid storage, such as atherosclerosis, obesity, type 2 diabetes mellitus, and hepatic steatosis. Consequently, there is an increasing need for a resource that combines large datasets from systematic analyses of LD biology. Here we integrate high-confidence, systematically generated data on studies of LDs in the framework of an online platform named the Lipid Droplet Knowledge Portal . This scalable and interactive portal includes comprehensive datasets, across a variety of cell types, for LD biology, including transcriptional profiles of induced lipid storage, organellar proteomics, genome-wide screen phenotypes, and ties to human genetics. This new resource is a powerful platform that can be utilized to uncover new determinants of lipid storage. HIGHLIGHTS ■ The LD-Portal is a resource combining datasets from systematic analyses in LD biology ■ The LD-Portal allows users to query genetic, proteomic, and phenotypic aspects of LD biology ■ The LD-Portal can be used to discover new facets of lipid storage and LD biology ■ A crucial function of MSRB3 is uncovered in cholesterol ester storage in LDs

SUMMARY White adipocytes function as the major energy reservoir in humans by storing substantial amounts of triglycerides and their dysfunction is associated with metabolic disorders. However, the mechanisms underlying cellular specialization during adipogenesis remain unknown. Here, using a high-sensitivity-high throughput workflow, we generated a spatiotemporal proteomic atlas of human adipogenesis encompassing information for ~8.000 proteins. Our systematic approach gives insights into cellular remodeling and the spatial reorganization of metabolic pathways to optimize cells for lipid accumulation and highlights the coordinated regulation of protein localization and abundance during adipogenesis. More specifically, we identified a compartment-specific regulation of protein levels and localization changes of metabolic enzymes to reprogram branched chain amino acid and one-carbon metabolism to provide building blocks and reduction equivalents for lipid synthesis. Additionally, we identified C19orf12 as a differentiation induced and adipocyte-specific lipid droplet (LD) protein, which interacts with the translocase of the outer membrane (TOM) complex of LD associated mitochondria and regulates adipocyte lipid storage. Overall, our study provides a comprehensive resource for understanding human adipogenesis and for future discoveries in the field. KEY POINTS Human adipogenesis induces distinct temporal changes in protein abundance 20% of all detected proteins change organellar localization during adipogenesis BCAA and one-carbon metabolism enzyme levels and localizations are coordinately regulated to promote adipogenesis C19orf12 is an adipocyte specific LD protein and regulator of lipid storage

Abstract Ferroptosis is an iron-dependent, non-apoptotic form of cell death initiated by oxidative stress and lipid peroxidation. Recent evidence has linked ferroptosis to the action of the transcription factor Nuclear factor erythroid-2 derived,-like-1 (NFE2L1). NFE2L1 regulates proteasome abundance in an adaptive fashion, maintaining protein quality control to secure cellular homeostasis, but the regulation of NFE2L1 during ferroptosis and the role of the ubiquitin-proteasome system (UPS) herein are still unclear. In the present study, using an unbiased proteomic approach charting the specific ubiquitylation sites, we show that induction of ferroptosis leads to recalibration of the UPS. RSL3-induced ferroptosis inhibits proteasome activity and leads to global hyperubiquitylation, which is linked to NFE2L1 activation. As NFE2L1 resides in the endoplasmic reticulum tethered to the membrane, it undergoes complex posttranslational modification steps to become active and induce the expression of proteasome subunit genes. We show that proteolytic cleavage of NFE2L1 by the aspartyl protease DNA-damage inducible 1 homolog 2 (DDI2) is a critical step for the ferroptosis-induced feed-back loop of proteasome function. Cells lacking DDI2 cannot activate NFE2L1 in response to RSL3 and show global hyperubiquitylation. Genetic or chemical induction of ferroptosis in cells with a disrupted DDI2-NFE2L1 pathway diminishes proteasomal activity and promotes cell death. Also, treating cells with the clinical drug nelfinavir, which inhibits DDI2, sensitized cells to ferroptosis. In conclusion, our results provide new insight into the importance of the UPS in ferroptosis and highlight the role of the DDI2-NFE2L1 as a potential therapeutic target. Manipulating DDI2-NFE2L1 activity through chemical inhibition might help sensitizing cells to ferroptosis, thus enhancing existing cancer therapies. Graphical abstract

Coronavirus disease 2019 (COVID-19), caused by the severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2), has been associated mainly with a range of neurological symptoms, including brain fog and brain tissue loss, raising concerns about the virus's acute and potential chronic impact on the central nervous system. In this study, we utilized mouse models and human post-mortem tissues to investigate the presence and distribution of the SARS-CoV-2 spike protein in the skull-meninges-brain axis. Our results revealed the accumulation of the spike protein in the skull marrow, brain meninges, and brain parenchyma. The injection of the spike protein alone caused cell death in the brain, highlighting a direct effect on brain tissue. Furthermore, we observed the presence of spike protein in the skull of deceased long after their COVID-19 infection, suggesting that the spike's persistence may contribute to long-term neurological symptoms. The spike protein was associated with neutrophil-related pathways and dysregulation of the proteins involved in the PI3K-AKT as well as complement and coagulation pathway. Overall, our findings suggest that SARS-CoV-2 spike protein trafficking from CNS borders into the brain parenchyma and identified differentially regulated pathways may present insights into mechanisms underlying immediate and long-term consequences of SARS-CoV-2 and present diagnostic and therapeutic opportunities.

Summary Internal tandem duplications (ITDs) in the FLT3 gene are frequently identified and confer a poor prognosis in patient affected by acute myeloid leukemia (AML). The insertion site of the ITDs in FLT3 significantly impacts the sensitivity to tyrosine kinase inhibitors (TKIs) therapy, affecting patient’s clinical outcome. To decipher the molecular mechanisms driving the different sensitivity to TKIs therapy of FLT3-ITD mutation, we used high-sensitive mass spectrometry-based (phospho)proteomics and deep sequencing. Here, we present a novel generally-applicable strategy that supports the integration of unbiased large-scale datasets with literature-derived signaling networks. The approach produced FLT3-ITDs specific predictive models and revealed a crucial and conserved role of the WEE1-CDK1 axis in TKIs resistance. Remarkably, we found that pharmacological inhibition of the WEE1 kinase synergizes and strengthens the pro-apoptotic effect of TKIs therapy in cell lines and patient-derived primary blasts. In conclusion, this work proposes a new molecular mechanism of TKIs resistance in AML and suggests a combination therapy as option to improve therapeutic efficacy.

Abstract Muscle function is an important denominator of energy balance and metabolic health. Adapting the proteome to energetic challenges, in response to diet or fasting, is facilitated by programs of proteostasis, but the adaptive role of the ubiquitin-proteasome system (UPS) in muscle remains unclear. Here, using a multi-omics approach, we uncover that the distinct metabolic condition of obesity is associated with recalibration of the UPS in muscle. Interestingly, obesity is associated with the activation of the transcription factor Nuclear factor, erythroid derived 2,- like 1 (Nfe2l1, also known as Nrf1), and loss of myocyte Nfe2l1 diminishes proteasomal activity and leads to hyperubiquitylation. Mice lacking Nfe2l1 display hormetic energy metabolism and resistance to diet-induced obesity, associated with a lean phenotype and muscle fiber type switching. In conclusion, we define a new adaptive role for UPS in remolding of muscle proteome and function, which is controlled by fine-tuning of proteasome function by Nfe2l1.

Progressive decline of pancreatic beta cells function is key to the pathogenesis of type 2 diabetes. Protein phosphorylation is the central mechanism controlling glucose-stimulated insulin secretion in beta cells. However, if and how signaling networks are remodeled in diabetic islets in vivo remain unknowns. Here we applied high-sensitivity mass spectrometry-based proteomics and quantified the levels of about 6,500 proteins and 13,000 phosphopeptides in islets of obese diabetic mice and matched controls. This highlighted drastic remodeling of key kinase hubs and signaling pathways. We integrated our phosphoproteomic dataset with a literature-derived signaling network, which revealed a crucial and conserved role of GSK3 kinase in the control of the beta cells-specific transcription factor PDX1 and insulin secretion. Our resource will enable the community to investigate potential mechanisms and drug targets in type 2 diabetes.

SUMMARY Hypothalamic astrocytes are particularly affected by energy-dense food consumption. How the anatomical location of these glial cells and their spatial molecular distribution in the arcuate nucleus of the hypothalamus (ARC) determine the cellular response to a high caloric diet remains unclear. In this study, we investigated their distinctive molecular responses following the exposure to a high-fat high-sugar (HFHS) diet, specifically in the ARC. Using RNA sequencing and proteomics, we showed that astrocytes have a distinct transcriptomic and proteomic profile dependent on their anatomical location, with a major proteomic reprogramming in hypothalamic astrocytes. By ARC single-cell sequencing, we observed that a HFHS diet dictates time- and cell-specific transcriptomic responses, revealing that astrocytes have the most distinct regulatory pattern compared to other cell types. Lastly, we topographically and molecularly characterized astrocytes expressing glial fibrillary acidic protein and/or aldehyde dehydrogenase 1 family member L1 in the ARC, of which the abundance was significantly increased, as well as the alteration in their spatial and molecular profiles, with a HFHS diet. Together, our results provide a detailed multi-omics view on the spatial and temporal changes of astrocytes particularly in the ARC during different time points of adaptation to a high caloric diet.