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Sijie Zheng
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MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy

Sijie Zheng et al.Feb 27, 2017
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MotionCor2 software corrects for beam-induced sample motion, improving the resolution of cryo-EM reconstructions.
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Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM

Xueming Li et al.May 3, 2013
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The combination of a direct electron-detection camera that can count individual electrons and an algorithm for correcting for beam-induced motion in cryo-EM will facilitate determination of three-dimensional structures of smaller, lower-symmetry macromolecular complexes to higher resolution than previously possible. In recent work with large high-symmetry viruses, single-particle electron cryomicroscopy (cryo-EM) has achieved the determination of near-atomic-resolution structures by allowing direct fitting of atomic models into experimental density maps. However, achieving this goal with smaller particles of lower symmetry remains challenging. Using a newly developed single electron–counting detector, we confirmed that electron beam–induced motion substantially degrades resolution, and we showed that the combination of rapid readout and nearly noiseless electron counting allow image blurring to be corrected to subpixel accuracy, restoring intrinsic image information to high resolution (Thon rings visible to ∼3 Å). Using this approach, we determined a 3.3-Å-resolution structure of an ∼700-kDa protein with D7 symmetry, the Thermoplasma acidophilum 20S proteasome, showing clear side-chain density. Our method greatly enhances image quality and data acquisition efficiency—key bottlenecks in applying near-atomic-resolution cryo-EM to a broad range of protein samples.
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A molecular pore spans the double membrane of the coronavirus replication organelle

Georg Wolff et al.Aug 6, 2020
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Viral RNA exported from the coronavirus replication organelle is likely to be mediated by a crown-shaped molecular pore.
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A molecular pore spans the double membrane of the coronavirus replication organelle

Georg Wolff et al.Jun 25, 2020
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Coronavirus genome replication is associated with virus-induced cytosolic double-membrane vesicles, which may provide a tailored micro-environment for viral RNA synthesis in the infected cell. However, it is unclear how newly synthesized genomes and mRNAs can travel from these sealed replication compartments to the cytosol to ensure their translation and the assembly of progeny virions. Here, using cellular electron cryo-microscopy, we unveiled a molecular pore complex that spans both membranes of the double-membrane vesicle and would allow export of RNA to the cytosol. A hexameric assembly of a large viral transmembrane protein was found to form the core of the crown-shaped complex. This coronavirus-specific structure likely plays a critical role in coronavirus replication and thus constitutes a novel drug target
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AreTomo: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction

Sijie Zheng et al.Feb 16, 2022
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Abstract AreTomo, an abbreviation for Alignment and Reconstruction for Electron Tomography, is a GPU accelerated software package that fully automates motion-corrected marker-free tomographic alignment and reconstruction in a single package. By correcting in-plane rotation, translation, and importantly, the local motion resulting from beam-induced motion from tilt to tilt, AreTomo can produce tomograms with sufficient accuracy to be directly used for subtomogram averaging. Another major application is the on-the-fly reconstruction of tomograms in parallel with tilt series collection to provide users with real-time feedback of sample quality allowing users to make any necessary adjustments of collection parameters. Here, the multiple alignment algorithms implemented in AreTomo are described and the local motions measured on a typical tilt series are analyzed. The residual local motion after correction for global motion was found in the range of ±80 Å, indicating that the accurate correction of local motion is critical for high-resolution cryo-electron tomography (cryoET).
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Anisotropic Correction of Beam-induced Motion for Improved Single-particle Electron Cryo-microscopy

Sijie Zheng et al.Jul 4, 2016
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Correction of electron beam-induced sample motion is one of the major factors contributing to the recent resolution breakthroughs in cryo-electron microscopy. Improving the accuracy and efficiency of motion correction can lead to further resolution improvement. Based on observations that the electron beam induces doming of the thin vitreous ice layer, we developed an algorithm to correct anisotropic image motion at the single pixel level across the whole frame, suitable for both single particle and tomographic images. Iterative, patch-based motion detection is combined with spatial and temporal constraints and dose weighting. The multi-GPU accelerated program, MotionCor2, is sufficiently fast to keep up with automated data collection. The result is an exceptionally robust strategy that can work on a wide range of data sets, including those very close to focus or with very short integration times, obviating the need for particle polishing. Application significantly improves Thon ring quality and 3D reconstruction resolution.
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Mind the gap: micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae

Georg Wolff et al.May 31, 2019
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Cryo-focussed ion beam (FIB)-milling of biological samples can be used to generate thin electron-transparent slices from cells grown or deposited on EM grids. These so called cryo-lamellae allow high-resolution structural studies of the natural cellular environment by in situ cryo-electron tomography. However, the cryo-lamella workflow is a low-throughput technique and can easily be hampered by technical issues like the bending of the lamellae during the final cryo-FIB-milling steps. The severity of lamella bending seems to correlate with shrinkage of the EM grid support film at cryogenic temperatures, which could generate tensions that may be transferred onto the thin lamella, leading to its bending and breakage. To protect the lamellae from these forces, we milled "micro-expansion joints" alongside the lamellae, creating gaps in the support that can act as physical buffers to safely absorb material motion. We demonstrate that the presence of such micro-expansion joints drastically decreases lamella bending. Furthermore, we show that this adaptation does not create instabilities that could constrain subsequent parts of the cryo-lamella workflow, as we obtained high-quality Volta phase plate tomograms revealing macromolecules in their natural structural context. The minimal additional effort required to implement micro-expansion joints in the cryo-FIB-milling workflow makes them an easy solution against cryo-lamella bending in any biological sample milled on EM grids.
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A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids

Eugene Palovcak et al.Mar 27, 2018
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Graphene oxide (GO) sheets have been used successfully as a supporting substrate film in several recent cryogenic electron-microscopy (cryo-EM) studies of challenging biological macromolecules. However, difficulties in preparing GO-covered holey carbon EM grids have limited its widespread use. Here, we report a simple and robust method for covering holey carbon EM grids with GO sheets and demonstrate that these grids are suitable for high-resolution single particle cryo-EM. GO substrates adhere macromolecules, allowing cryo-EM grid preparation with lower specimen concentrations and providing partial protection from the air-water interface. Additionally, the signal from images of the GO lattice beneath the frozen-hydrated specimen can be discerned in many motion-corrected micrographs, providing a high-resolution fiducial for evaluating beam-induced motion correction.
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Automating Workflows for Cryo-Electron Tomography with an Open-Source and Comprehensive Data-Pipeline

Jonathan Schwartz et al.Jul 1, 2024
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