In the course of Parkinson's disease (PD), the enteric nervous system (ENS) and parasympathetic nerves are amongst the structures earliest and most frequently affected by alpha-synuclein pathology. Accordingly, gastrointestinal dysfunction, in particular constipation, is an important non-motor symptom in PD and often precedes the onset of motor symptoms by years. Recent research has shown that intestinal microbiota interact with the autonomic and central nervous system via diverse pathways including the ENS and vagal nerve. The gut microbiome in PD has not been previously investigated. We compared the fecal microbiomes of 72 PD patients and 72 control subjects by pyrosequencing the V1-V3 regions of the bacterial 16S ribosomal RNA gene. Associations between clinical parameters and microbiota were analyzed using generalized linear models, taking into account potential confounders. On average, the abundance of Prevotellaceae in feces of PD patients was reduced by 77.6% as compared with controls. Relative abundance of Prevotellaceae of 6.5% or less had 86.1% sensitivity and 38.9% specificity for PD. A logistic regression classifier based on the abundance of four bacterial families and the severity of constipation identified PD patients with 66.7% sensitivity and 90.3% specificity. The relative abundance of Enterobacteriaceae was positively associated with the severity of postural instability and gait difficulty. These findings suggest that the intestinal microbiome is altered in PD and is related to motor phenotype. Further studies are warranted to elucidate the temporal and causal relationships between gut microbiota and PD and the suitability of the microbiome as a biomarker.

Background & Aims: Irritable bowel syndrome (IBS) is a significant gastrointestinal disorder with unknown etiology. The symptoms can greatly weaken patients’ quality of life and account for notable economical costs for society. Contribution of the gastrointestinal microbiota in IBS has been suggested. Our objective was to characterize putative differences in gastrointestinal microbiota between patients with IBS and control subjects. These differences could potentially have a causal relationship with the syndrome. Methods: Microbial genomes from fecal samples of 24 patients with IBS and 23 controls were collected, pooled in a groupwise manner, and fractionated according to their guanine cytosine content. Selected fractions were analyzed by extensive high-throughput 16S ribosomal RNA gene cloning and sequencing of 3753 clones. Some of the revealed phylogenetic differences were further confirmed by quantitative polymerase chain reaction assays on individual samples. Results: The coverage of the clone libraries of IBS subtypes and control subjects differed significantly (P < .0253). The samples were also distinguishable by the Bayesian analysis of bacterial population structure. Moreover, significant (P < .05) differences between the clone libraries were found in several bacterial genera, which could be verified by quantitative polymerase chain reaction assays of phylotypes belonging to the genera Coprococcus, Collinsella, and Coprobacillus. Conclusions: The study showed that fecal microbiota is significantly altered in IBS. Further studies on molecular mechanisms underlying these alterations are needed to elucidate the exact role of intestinal bacteria in IBS. Background & Aims: Irritable bowel syndrome (IBS) is a significant gastrointestinal disorder with unknown etiology. The symptoms can greatly weaken patients’ quality of life and account for notable economical costs for society. Contribution of the gastrointestinal microbiota in IBS has been suggested. Our objective was to characterize putative differences in gastrointestinal microbiota between patients with IBS and control subjects. These differences could potentially have a causal relationship with the syndrome. Methods: Microbial genomes from fecal samples of 24 patients with IBS and 23 controls were collected, pooled in a groupwise manner, and fractionated according to their guanine cytosine content. Selected fractions were analyzed by extensive high-throughput 16S ribosomal RNA gene cloning and sequencing of 3753 clones. Some of the revealed phylogenetic differences were further confirmed by quantitative polymerase chain reaction assays on individual samples. Results: The coverage of the clone libraries of IBS subtypes and control subjects differed significantly (P < .0253). The samples were also distinguishable by the Bayesian analysis of bacterial population structure. Moreover, significant (P < .05) differences between the clone libraries were found in several bacterial genera, which could be verified by quantitative polymerase chain reaction assays of phylotypes belonging to the genera Coprococcus, Collinsella, and Coprobacillus. Conclusions: The study showed that fecal microbiota is significantly altered in IBS. Further studies on molecular mechanisms underlying these alterations are needed to elucidate the exact role of intestinal bacteria in IBS. See editorial on page 340. See editorial on page 340. Irritable bowel syndrome (IBS) is a common functional gastrointestinal (GI) disorder with a worldwide prevalence of 10%–20%.1Longstreth G.F. Thompson W.G. Chey W.D. Houghton L.A. Mearin F. Spiller R.C. Functional bowel disorders.Gastroenterology. 2006; 130: 1480-1491Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4031) Google Scholar Although IBS does not predispose patients to severe illness, it can have significant effects on their well-being and need for medical consultation. The symptoms of IBS vary with affected individuals and include abdominal pain or discomfort, irregular bowel movements, flatulence, and constipation or diarrhea. Patients with IBS can be grouped into 3 subtypes according to their bowel habit.1Longstreth G.F. Thompson W.G. Chey W.D. Houghton L.A. Mearin F. Spiller R.C. Functional bowel disorders.Gastroenterology. 2006; 130: 1480-1491Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4031) Google Scholar, 2Drossman D.A. Corazziari E. Talley N.J. Thompson W.G. Whitehead W.E. Rome II: the functional gastrointestinal disorders. 2nd ed. Degnon Associates, McLean, VA2000Google Scholar These are diarrhea predominant (IBS-D), constipation predominant (IBS-C), and mixed subtype (IBS-M), which refers to patients with symptoms of both diarrhea and constipation. The etiology of IBS is poorly understood. Miscellaneous causes, including physiologic features such as altered GI motility and visceral hypersensitivity, psychological stress and disturbances, low-grade inflammation, and bacterial gastroenteritis, have been associated with IBS.3Drossman D.A. Camilleri M. Mayer E.A. Whitehead W.E. AGA technical review on irritable bowel syndrome.Gastroenterology. 2002; 123: 2108-2131Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1228) Google Scholar The microbiota of the human GI tract constitutes a complex ecosystem that is involved in the health and physiologic functions of the host. Alterations of the normal GI microbiota have been shown to take place as a result of antibiotic therapies4Mellon A.F. Deshpande S.A. Mathers J.C. Bartlett K. Effect of oral antibiotics on intestinal production of propionic acid.Arch Dis Child. 2000; 82: 169-172Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar and the use of probiotics,5Surawicz C.M. Probiotics, antibiotic-associated diarrhoea and Clostridium difficile diarrhoea in humans.Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2003; 17: 775-783Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (111) Google Scholar in connection with various dietary strategies,6Hayashi H. Sakamoto M. Benno Y. Fecal microbial diversity in a strict vegetarian as determined by molecular analysis and cultivation.Microbiol Immunol. 2002; 46: 819-831PubMed Google Scholar and with obesity.7Bajzer M. Seeley R.J. Obesity and gut flora.Nature. 2006; 444: 1009-1010Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar, 8Ley R.E. Turnbaugh P.J. Klein S. Gordon J.I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity.Nature. 2006; 444: 1022-1023Crossref PubMed Scopus (6687) Google Scholar Moreover, bacteria belonging to the normal microbiota seem also to be capable of causing disease in some individuals and may have a role in certain disorders, such as inflammatory bowel disease,9Wensinck F. Proceedings: the faecal flora of patients with Crohn’s disease.Antonie van Leeuwenhoek. 1975; 41: 214-215Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar, 10Seksik P. Rigottier-Gois L. Gramet G. Sutren M. Pochart P. Marteau P. Jian R. Dore J. Alterations of the dominant faecal bacterial groups in patients with Crohn’s disease of the colon.Gut. 2003; 52: 237-242Crossref PubMed Scopus (588) Google Scholar, 11Ott S.J. Musfeldt M. Wenderoth D.F. Hampe J. Brant O. Folsch U.R. Timmis K.N. Schreiber S. Reduction in diversity of the colonic mucosa associated bacterial microflora in patients with active inflammatory bowel disease.Gut. 2004; 53: 685-693Crossref PubMed Scopus (955) Google Scholar allergies,12Kirjavainen P.V. Apostolou E. Arvola T. Salminen S.J. Gibson G.R. Isolauri E. Characterizing the composition of intestinal microflora as a prospective treatment target in infant allergic disease.FEMS Immunol Med Microbiol. 2001; 32: 1-7Crossref PubMed Google Scholar, 13Watanabe S. Narisawa Y. Arase S. Okamatsu H. Ikenaga T. Tajiri Y. Kumemura M. Differences in fecal microflora between patients with atopic dermatitis and healthy control subjects.J Allergy Clin Immunol. 2003; 111: 587-591Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (306) Google Scholar and IBS.14Balsari A. Ceccarelli A. Dubini F. Fesce E. Poli G. The fecal microbial population in the irritable bowel syndrome.Microbiologica. 1982; 5: 185-194PubMed Google Scholar, 15King T.S. Elia M. Hunter J.O. Abnormal colonic fermentation in irritable bowel syndrome.Lancet. 1998; 352: 1187-1189Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (418) Google Scholar, 16Rodriguez L.A. Ruigomez A. Increased risk of irritable bowel syndrome after bacterial gastroenteritis: cohort study.BMJ (Clin Res Ed). 1999; 318: 565-566Crossref PubMed Google Scholar, 17Si J.M. Yu Y.C. Fan Y.J. Chen S.J. Intestinal microecology and quality of life in irritable bowel syndrome patients.World J Gastroenterol. 2004; 10: 1802-1805Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar Conventional culture-based methods provide an incomplete and biased picture of the biodiversity of intestinal microbiota, because the majority of the GI tract bacterial species cannot be cultivated.18Suau A. Bonnet R. Sutren M. Godon J.J. Gibson G.R. Collins M.D. Dore J. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut.Appl Environ Microbiol. 1999; 65: 4799-4807PubMed Google Scholar To overcome these drawbacks, culture-independent molecular methods have been introduced. These methods are mainly based on ribosomal RNA (rRNA) genes that reflect the natural evolutionary relationships among different organisms. The microbial composition of human intestinal microbiota has been studied, for example, by sequencing the 16S rRNA genes of clones obtained by amplification with polymerase chain reaction (PCR) from fecal DNA preparations.19Wilson K.H. Blitchington R.B. Human colonic biota studied by ribosomal DNA sequence analysis.Appl Environ Microbiol. 1996; 62: 2273-2278PubMed Google Scholar However, multitemplate PCR amplification causes a bias in favor of dominant and low guanine-plus-cytosine (G+C) content bacteria.20Reysenbach A.L. Giver L.J. Wickham G.S. Pace N.R. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction.Appl Environ Microbiol. 1992; 58: 3417-3418PubMed Google Scholar Fractionating the DNA preparations according to the sample G+C percentage (%G+C) has been shown to allow less abundant species as well as sequences with high G+C contents to be amplified by PCR when studying environmental bacterial samples.21Holben W.E. Harris D. DNA-based monitoring of total bacterial community structure in environmental samples.Mol Ecol. 1995; 4: 627-631Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar Fractionation according to the %G+C content thus enriches considerably the diversity of sequences obtained by cloning and sequencing. In this study, we applied the %G+C profiling and extensive 16S rRNA gene cloning and sequencing to compare the fecal microbiota of patients with IBS with that of control subjects using pooled samples to overcome individual variation not originating from the subjects’ IBS status. The combination of these 2 methods, applied for the first time for studying human gut microbiota, showed exceptionally high resolution and allowed a very detailed analysis of the bacterial populations. With this extensive molecular characterization, significant differences between the GI microbiota of symptomatically categorized patients with IBS and age- and sex-matched volunteers devoid of GI disturbances were revealed both in the microbial community structures (%G+C profiling) as well as on genus-level bacterial composition (cloning and sequencing). The detected divergences in the bacterial phylotypes could be verified from fecal DNA preparations of individual subjects already with a small primary set of quantitative real-time PCR (qPCR) assays using primers designed specifically for the phylogenetic differences found. In this study, we characterized the GI microbiota in the fecal samples of 24 patients with IBS and 23 sex- and age-matched control individuals. These samples were previously analyzed by qPCR with a set of primers targeting selected known GI bacterial groups.22Malinen E. Rinttilä T. Kajander K. Mättö J. Kassinen A. Krogius L. Saarela M. Korpela R. Palva A. Analysis of the fecal microbiota of irritable bowel syndrome patients and healthy controls with real-time PCR.Am J Gastroenterol. 2005; 100: 373-382Crossref PubMed Scopus (608) Google Scholar The patients with IBS were recruited by experienced physicians (Table 1). The patients fulfilled the Rome II criteria for IBS,23Thompson W.G. Longstreth G.F. Drossman D.A. Heaton K.W. Irvine E.J. Muller-Lissner S.A. Functional bowel disorders and functional abdominal pain.Gut. 1999; 45: II43-II47Crossref PubMed Scopus (2043) Google Scholar except for 3 subjects who reported slightly less than 12 weeks of abdominal pain during the preceding year. All patients with IBS had undergone clinical investigation and endoscopy or barium enema of the GI tract less than 1 year before being recruited. The patients were classified as having IBS-C, IBS-D, or IBS-M by a questionnaire following the Rome II subgrouping criteria,2Drossman D.A. Corazziari E. Talley N.J. Thompson W.G. Whitehead W.E. Rome II: the functional gastrointestinal disorders. 2nd ed. Degnon Associates, McLean, VA2000Google Scholar which have been recognized as valid also in the Rome III criteria.1Longstreth G.F. Thompson W.G. Chey W.D. Houghton L.A. Mearin F. Spiller R.C. Functional bowel disorders.Gastroenterology. 2006; 130: 1480-1491Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4031) Google Scholar The participants gave their written informed consent and were permitted to withdraw from the study at any time. For the IBS patients, the study protocol had the approval of the Human Ethics Committee at the Joint Authority for the Hospital District of Helsinki and Uusimaa. Healthy control subjects devoid of GI symptoms were recruited to form an age- and sex-matched control group for the patients with IBS (Table 1). Intestinal disturbances (including lactose intolerance and celiac disease) and ongoing antibiotic treatments were considered exclusion criteria for the control group.Table 1Characteristics of Patients With IBS and ControlsVariablePatients With IBSControlsAge (y), mean (range)47.3 (21–65)45.2 (26–64)Sex (F/M)19/516/7Predominant bowel habit, n (%) Diarrhea10 (42) Constipation8 (33) Mixed type6 (25)Exclusion criteriaPregnancyLactationOrganic GI diseaseSevere systematic diseaseMajor or complicated abdominal surgerySevere endometriosisDementiaGI symptomsOngoing antibiotic treatment+ All exclusion criteria of the patients with IBS Open table in a new tab A total of 24 patients with IBS classified as IBS-D (n = 10), IBS-C (n = 8), or IBS-M (n = 6) and 23 volunteer control subjects donated fecal samples. Bacterial genomic DNA was extracted as described by Apajalahti et al.24Apajalahti J.H. Särkilahti L.K. Mäki B.R. Heikkinen J.P. Nurminen P.H. Holben W.E. Effective recovery of bacterial DNA and percent-guanine-plus-cytosine-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens.Appl Environ Microbiol. 1998; 64: 4084-4088PubMed Google Scholar The DNA preparations were subsequently pooled (IBS-D, IBS-C, IBS-M, and control), centrifuged in a cesium chloride/bisbenzimidazole gradient, and divided into fractions within 5% intervals according to their G+C content.25Holben W.E. Jansson J.K. Chelm B.K. Tiedje J.M. DNA probe method for the detection of specific microorganisms in the soil bacterial community.Appl Environ Microbiol. 1988; 54: 703-711PubMed Google Scholar The %G+C fractions displaying the most variation between pooled DNA specimens were selected for further analysis (fraction 7 [%G+C, 25–30], fraction 10 [%G+C, 40–45], and fraction 13 [%G+C, 55–60]) (Figure 1). To study whether the differences observed in the %G+C profiles were significant, the divergent fractions were subjected to cloning and sequencing of the 16S rRNA gene. The selected fractions of 4 pooled samples were cloned and sequenced with a high-throughput protocol. The cloning was performed with the Qiagen PCR Cloning plus Kit (Qiagen, Hilden, Germany) by using independently 2 universal 16S rRNA gene PCR primer pairs. The first primer pair corresponded to the Escherichia coli 16S rRNA gene in the positions 8–27 base pairs (bp) and 1492–1512 bp,18Suau A. Bonnet R. Sutren M. Godon J.J. Gibson G.R. Collins M.D. Dore J. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut.Appl Environ Microbiol. 1999; 65: 4799-4807PubMed Google Scholar, 26Hicks R.E. Amann R.I. Stahl D.A. Dual staining of natural bacterioplankton with 4′,6-diamidino-2-phenylindole and fluorescent oligonucleotide probes targeting kingdom-level 16S rRNA sequences.Appl Environ Microbiol. 1992; 58: 2158-2163PubMed Google Scholar and the second primer pair corresponded to the Escherichia coli 16S rRNA gene in the positions 7–27 bp and 1522–1541 bp.27Wang R.F. Kim S.J. Robertson L.H. Cerniglia C.E. Development of a membrane-array method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samples.Mol Cell Probes. 2002; 16: 341-350Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar A PCR protocol of minimum amount of cycles (20 cycles for fraction 7 and 27 cycles for fractions 10 and 13) was applied for each fraction to avoid biases in favor of abundant templates. The 2 amplicons were mixed in a 1:1 molecular ratio before cloning, and a library of nearly 14,000 clones was constructed. From each fraction, the 5′ end of the 16S rRNA gene was sequenced from 384 clones with the sequencing primer corresponding to the E coli 16S rRNA gene position 536–518 bp.28Edwards U. Rogall T. Blocker H. Emde M. Bottger E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA.Nucleic Acids Res. 1989; 17: 7843-7853Crossref PubMed Scopus (2289) Google Scholar The BigDye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) and an ABI 3700 Capillary DNA Sequencer (GMI, Ramsey, MN) were used to analyze the products. All sequences were checked manually with the Staden program package.29Staden R. Beal K.F. Bonfield J.K. The Staden package, 1998 Methods in molecular biology. The Humana Press Inc., Totowa, Clifton, NJ2000: 115-130Google Scholar Putative chimeras were eliminated from sequences aligned with ClustalW.30Chenna R. Sugawara H. Koike T. Lopez R. Gibson T.J. Higgins D.G. Thompson J.D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.Nucleic Acids Res. 2003; 31: 3497-3500Crossref PubMed Scopus (4130) Google Scholar The number of operational taxonomic units (OTUs) was determined with DOTUR.31Schloss P.D. Handelsman J. Introducing DOTUR, a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness.Appl Environ Microbiol. 2005; 71: 1501-1506Crossref PubMed Scopus (2127) Google Scholar Each sequence was checked against the EMBL Nucleotide Sequence Database with Fasta homology search program at http://www.ebi.ac.uk/fasta33/nucleotide.html.32Pearson W.R. Lipman D.J. Improved tools for biological sequence comparison.Proc Natl Acad Sci U S A. 1988; 85: 2444-2448Crossref PubMed Scopus (10130) Google Scholar Sequences with <95% similarity to existing entries in the EMBL Nucleotide Sequence Databases of prokaryotes and environmental samples were considered novel. These were further sequenced to nearly full-length 16S rRNA gene using the vector primers T7 and SP6 (Qiagen PCR Cloning plus Kit) and primers corresponding to the E coli 16S rRNA gene in the positions 908–928 bp and 1073–1053 bp.28Edwards U. Rogall T. Blocker H. Emde M. Bottger E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA.Nucleic Acids Res. 1989; 17: 7843-7853Crossref PubMed Scopus (2289) Google Scholar After the supplementary sequencing, they were reanalyzed with the Fasta and Ribosomal Database Project II (RDP II) Classifier Tool (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)33Cole J.R. Chai B. Farris R.J. Wang Q. Kulam S.A. McGarrell D.M. Garrity G.M. Tiedje J.M. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.Nucleic Acids Res. 2005; 33: D294-D296Crossref PubMed Scopus (1259) Google Scholar to assign them into phyla. The statistical comparisons of the individual clone libraries representing the 3 different IBS symptom subtypes and the control were performed with 3 individual methods revealing different aspects: the ∫-LIBSHUFF program,34Schloss P.D. Larget B.R. Handelsman J. Integration of microbial ecology and statistics: a test to compare gene libraries.Appl Environ Microbiol. 2004; 70: 5485-5492Crossref PubMed Scopus (296) Google Scholar BAPS 4.1 program for Bayesian analysis of genetic population structure,35Corander J. Tang J. Bayesian analysis of population structure based on linked molecular information.Math Biosci. 2007; 205: 19-31Crossref PubMed Scopus (197) Google Scholar and the RDP II Library Compare Tool (http://rdp.cme.msu.edu/comparison/comp.jsp).33Cole J.R. Chai B. Farris R.J. Wang Q. Kulam S.A. McGarrell D.M. Garrity G.M. Tiedje J.M. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.Nucleic Acids Res. 2005; 33: D294-D296Crossref PubMed Scopus (1259) Google Scholar The ∫-LIBSHUFF analysis generates the homologous and heterologous coverage curves from the 16S rRNA clone libraries and thus analyzes the differences in the libraries based on Good’s formula of coverage.36Good I.J. The population frequencies of species and the estimation of population parameters.Biometrika. 1953; : 237-264Google Scholar In the Bayesian analysis, we used the unsupervised sequence classification option of BAPS 4.1 to discover homogeneous subgroups in the investigated microbiota. The resulting groups within each fraction were further analyzed using multidimensional scaling based on the average relative sequence dissimilarity to discover whether there are systematic differences in the sample composition between the control and the symptom subtypes.37Seber G.A.F. Multivariate observations. Wiley, Mississauga, Canada1984Crossref Google Scholar Furthermore, the RDP II Library Compare Tool33Cole J.R. Chai B. Farris R.J. Wang Q. Kulam S.A. McGarrell D.M. Garrity G.M. Tiedje J.M. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.Nucleic Acids Res. 2005; 33: D294-D296Crossref PubMed Scopus (1259) Google Scholar was used to test whether the corresponding sequence libraries diverged from each other at the genus level. The comparisons were run with a bootstrapping confidence threshold of 95%. The Library Compare Tool uses naive Bayesian rRNA classifier to assign sequences in the 16S rRNA gene libraries under comparison to taxa and subsequently estimates the significance of the observed differences.33Cole J.R. Chai B. Farris R.J. Wang Q. Kulam S.A. McGarrell D.M. Garrity G.M. Tiedje J.M. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.Nucleic Acids Res. 2005; 33: D294-D296Crossref PubMed Scopus (1259) Google Scholar From the output, the genus-level results were selected. For phylogenetic comparison of gene libraries, all sequences were aligned using the ARB program designed for 16S rRNA gene sequence database handling and data analysis.38Ludwig W. Strunk O. Westram R. Richter L. Meier H. Yadhukumar Buchner A. Lai T. Steppi S. Jobb G. Forster W. Brettske I. Gerber S. Ginhart A.W. Gross O. Grumann S. Hermann S. Jost R. Konig A. Liss T. Lussmann R. May M. Nonhoff B. Reichel B. Strehlow R. Stamatakis A. Stuckmann N. Vilbig A. Lenke M. Ludwig T. Bode A. Schleifer K.H. ARB: a software environment for sequence data.Nucleic Acids Res. 2004; 32: 1363-1371Crossref PubMed Scopus (5381) Google Scholar For some of the sections of the tree, where putative deviation could be seen between the pooled samples, qPCR primers were designed. The primers and their optimal annealing temperatures are shown in Table 2. The qPCR primers corresponded to phylotypes belonging to a particular species or resembling the given species by a denoted percentage: Ruminococcus torques, 91%; Clostridium cocleatum, 88%; Coprococcus eutactus, 97%; Ruminococcus torques, 94%; Collinsella aerofaciens; Bifidobacterium catenulatum; Lactobacillus farciminis; Lactobacillus gasseri; Streptococcus bovis; and to all eubacteria with universal primers.39Nadkarni M.A. Martin F.E. Jacques N.A. Hunter N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set.Microbiology. 2002; 148: 257-266Crossref PubMed Scopus (1512) Google Scholar Quantitative PCR was performed with an iCycler iQ apparatus (Bio-Rad, Hercules, CA) using SYBR Green I detection chemistry according to Malinen et al.22Malinen E. Rinttilä T. Kajander K. Mättö J. Kassinen A. Krogius L. Saarela M. Korpela R. Palva A. Analysis of the fecal microbiota of irritable bowel syndrome patients and healthy controls with real-time PCR.Am J Gastroenterol. 2005; 100: 373-382Crossref PubMed Scopus (608) Google Scholar A set of 22 control samples and 24 IBS patient samples consisting of 10 IBS-D, 8 IBS-C, and 6 IBS-M subtypes were analyzed. All qPCR reactions were performed using triplicate parallel samples. For statistical analysis of the results, the control samples were compared with the IBS patient samples using the Mann–Whitney test.Table 2Real-Time PCR Primers for Selected Sequence GroupsTarget species/groupControl sequenceSequence lengthTmForward primerReverse primerB catenulatum/B pseudocatenulatumAM277149275685′-ACTCCTCGCATGGGGTGTC-3′5′-CCGAAGGCTTGCTCCCGAT-3′C cocleatum 88%AM276544104605′-AATACATAAGTAACCTGGCRTC-3′5′-CGTAGCACTTTTCATATAGAGTT-3′C aerofaciensAM276107260675′-CCCGACGGGAGGGGAT-3′5′-CTTCTGCAGGTACAGTCTTGA-3′C eutactus 97%AM27582597635′-AGCTTGCTCCGGCYGATTTA-3′5′-CGGTTTTACCAGTCGTTTCCAA-3′L farciminisAM275648127635′-ATGATTCAGAYCTTGGTGAG-3′5′-AAGCTACGATCATGTGAAAGTA-3′L gasseriAM275470160635′-ATTTGGTGCTTGCACCAGA-3′5′-CAGAACCATCTTTTAAACTCTAGA-3′R torques 91%AM276558119625′-TGCTTAACTGATCTTCTTCGGA-3′5′-CGGTATTAGCAGTCATTTCTG-3′R torques 94%AM275522137655′-AATCTTCGGAGGAAGAGGACA-3′5′-ACACTACACCATGCGGTCCT-3′S bovisAM276559150605′-TTAGCTTGCTAAAGTTGGAA-3′5′-ATCTACTAGTGAAGCAATTGCT-3′UniversalB longum DSM 20219466505′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′NOTE. Percentages in the names of target species refer to the sequence homology with nearest cultured bacterial species. Tm values refer to optimized annealing temperatures used in each assay. Open table in a new tab NOTE. Percentages in the names of target species refer to the sequence homology with nearest cultured bacterial species. Tm values refer to optimized annealing temperatures used in each assay. The obtained sequences were deposited to the EMBL Nucleotide Sequence Database under the accession numbers AM275396–AM279148. Genomic bacterial DNA from fecal samples was subjected to a %G+C profile analysis in which the genomes become differentiated according to their %G+C content. In this community-level analysis, considerable differences were detected among the 4 pooled samples of IBS-D, IBS-C, IBS-M, and healthy control subjects in 3 distinct %G+C fractions (fraction 7 [%G+C, 25–30], fraction 10 [%G+C, 40–45], and fraction 13 [%G+C, 55–60]) (Figure 1). The %G+C profile is a culture-independent but rather robust and coarse characterization of the total bacterial community structure; thus, observed differences may be caused by number of bacterial species of %G+C content corresponding to the fraction in question. Therefore, these 3 fraction groups were directed to high-throughput DNA cloning and sequencing analyses. From 14,000 clones in the 16S rRNA gene library constructed, 4,608 sequences, encompassing approximately 450 bp from the 5′ end of the 16S rRNA gene, were gathered. After excluding sequences of weak quality or chimeric structure, the success rate of sequencing was approximately 81%. According to Good’s formula,36Good I.J. The population frequencies of species and the estimation of population parameters.Biometrika. 1953; : 237-264Google Scholar the coverage of clone libraries ranged from 80% to 93%. Table 3 illustrates the number of sequences acquired and the number of OTUs these sequences represent when a similarity criterion of 98% was used. A total of 79 novel phylotypes were detected, after which the corresponding clones were further sequenced to obtain the almost complete 16S rRNA gene sequence. After a subsequent Fasta search, 53 phylotypes, representing altogether 98 sequences, remained previously uncharacterized novel ones (Table 4).Table 3Number of Sequences and OTUs in Each Clone LibrarySampleSequencesOTUsFraction 7 Control31991 IBS-M324108 IBS-C29163 IBS-D34270Fraction 10 Control346119 IBS-M327100 IBS-C32390 IBS-D31878Fraction 13 Control31145 IBS-M28961 IBS-C29170 IBS-D27250NOTE. DOTUR was used for the calculation of OTUs with 98% similarity criteria. Open table in a new tab Table 4Novel Near Full-Length 16S rRNA Sequences in All Samples With <95% Similarity to Any EMBL SequencePhylumAccession no.SampleSimilarity (%)Closest neighborDescriptionSourceActinobacteriaAM275775Control88.554AY959023Uncultured bacteriaHuman vaginaFirmicutesAM275415Control89.624DQ394685Uncultured bacteriaCow rumenActinobacteriaAM275737Control90.283DQ353921Uncultured bacteriaWild gorilla fecesFirmicutesAM275764Control90.606DQ394628Uncultured bacteriaReindeer rumenBacteroidetesAM275765Control90.817AJ400236Uncultured bacteriaMouse fecesFirmicutesAM275604Control91.764AF129867Uncultured bacteriaAnaerobic digesterFirmicutesAM275757Control92.158AB185775Uncultured bacteriaCow rumenAc

Rapidly declining biodiversity may be a contributing factor to another global megatrend—the rapidly increasing prevalence of allergies and other chronic inflammatory diseases among urban populations worldwide. According to the “biodiversity hypothesis,” reduced contact of people with natural environmental features and biodiversity may adversely affect the human commensal microbiota and its immunomodulatory capacity. Analyzing atopic sensitization (i.e., allergic disposition) in a random sample of adolescents living in a heterogeneous region of 100 × 150 km, we show that environmental biodiversity in the surroundings of the study subjects’ homes influenced the composition of the bacterial classes on their skin. Compared with healthy individuals, atopic individuals had lower environmental biodiversity in the surroundings of their homes and significantly lower generic diversity of gammaproteobacteria on their skin. The functional role of the Gram-negative gammaproteobacteria is supported by in vitro measurements of expression of IL-10, a key anti-inflammatory cytokine in immunologic tolerance, in peripheral blood mononuclear cells. In healthy, but not in atopic, individuals, IL-10 expression was positively correlated with the abundance of the gammaproteobacterial genus Acinetobacter on the skin. These results raise fundamental questions about the consequences of biodiversity loss for both allergic conditions and public health in general.

To unravel the biological function of the widely used probiotic bacterium Lactobacillus rhamnosus GG, we compared its 3.0-Mbp genome sequence with the similarly sized genome of L. rhamnosus LC705, an adjunct starter culture exhibiting reduced binding to mucus. Both genomes demonstrated high sequence identity and synteny. However, for both strains, genomic islands, 5 in GG and 4 in LC705, punctuated the colinearity. A significant number of strain-specific genes were predicted in these islands (80 in GG and 72 in LC705). The GG-specific islands included genes coding for bacteriophage components, sugar metabolism and transport, and exopolysaccharide biosynthesis. One island only found in L. rhamnosus GG contained genes for 3 secreted LPXTG-like pilins ( spaCBA ) and a pilin-dedicated sortase. Using anti-SpaC antibodies, the physical presence of cell wall-bound pili was confirmed by immunoblotting. Immunogold electron microscopy showed that the SpaC pilin is located at the pilus tip but also sporadically throughout the structure. Moreover, the adherence of strain GG to human intestinal mucus was blocked by SpaC antiserum and abolished in a mutant carrying an inactivated spaC gene. Similarly, binding to mucus was demonstrated for the purified SpaC protein. We conclude that the presence of SpaC is essential for the mucus interaction of L. rhamnosus GG and likely explains its ability to persist in the human intestinal tract longer than LC705 during an intervention trial. The presence of mucus-binding pili on the surface of a nonpathogenic Gram-positive bacterial strain reveals a previously undescribed mechanism for the interaction of selected probiotic lactobacilli with host tissues.

Abstract Background Composting is an aerobic microbiological process that is facilitated by bacteria and fungi. Composting is also a method to produce fertilizer or soil conditioner. Tightened EU legislation now requires treatment of the continuously growing quantities of organic municipal waste before final disposal. However, some full-scale composting plants experience difficulties with the efficiency of biowaste degradation and with the emission of noxious odours. In this study we examine the bacterial species richness and community structure of an optimally working pilot-scale compost plant, as well as a full-scale composting plant experiencing typical problems. Bacterial species composition was determined by isolating total DNA followed by amplifying and sequencing the gene encoding the 16S ribosomal RNA. Results Over 1500 almost full-length 16S rRNA gene sequences were analysed and of these, over 500 were present only as singletons. Most of the sequences observed in either one or both of the composting processes studied here were similar to the bacterial species reported earlier in composts, including bacteria from the phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria and Deinococcus-Thermus. In addition, a number of previously undetected bacterial phylotypes were observed. Statistical calculations estimated a total bacterial diversity of over 2000 different phylotypes in the studied composts. Conclusions Interestingly, locally enriched or evolved bacterial variants of familiar compost species were observed in both composts. A detailed comparison of the bacterial diversity revealed a large difference in composts at the species and strain level from the different composting plants. However, at the genus level, the difference was much smaller and illustrated a delay of the composting process in the full-scale, sub-optimally performing plants.

We spend most of our lives in indoor environments and are exposed to microbes present in these environments. Hence, knowledge about this exposure is important for understanding how it impacts on human health. However, the bacterial flora in indoor environments has been only fragmentarily explored and mostly using culture methods. The application of molecular methods previously utilised in other environments has resulted in a substantial increase in our awareness of microbial diversity.The composition and dynamics of indoor dust bacterial flora were investigated in two buildings over a period of one year. Four samples were taken in each building, corresponding to the four seasons, and 16S rDNA libraries were constructed. A total of 893 clones were analysed and 283 distinct operational taxonomic units (OTUs) detected among them using 97% sequence similarity as the criterion. All libraries were dominated by Gram-positive sequences, with the most abundant phylum being Firmicutes. Four OTUs having high similarity to Corynebacterium-, Propionibacterium-, Streptococcus- and Staphylococcus- sequences were present in all samples. The most abundant of the Gram-negative OTUs were members of the family Sphingomonadaceae, followed by Oxalobacteraceae, Comamonadaceae, Neisseriaceae and Rhizobiaceae. The relative abundance of alpha- and betaproteobacteria increased slightly towards summer at the expense of firmicutes. The proportion of firmicutes and gammaproteobacteria of the total diversity was highest in winter and that of actinobacteria, alpha- and betaproteobacteria in spring or summer, whereas the diversity of bacteroidetes peaked in fall. A statistical comparison of the libraries revealed that the bacterial flora of the two buildings differed during all seasons except spring, but differences between seasons within one building were not that clear, indicating that differences between the buildings were greater than the differences between seasons.This work demonstrated that the bacterial flora of indoor dust is complex and dominated by Gram-positive species. The dominant phylotypes most probably originated from users of the building. Seasonal variation was observed as proportional changes of the phyla and at the species level. The microflora of the two buildings investigated differed statistically and differences between the buildings were more pronounced than differences between seasons.

Abstract Background A growing amount of scientific evidence suggests that microbes are involved in the aetiology of irritable bowel syndrome (IBS), and the gastrointestinal (GI) microbiota of individuals suffering from diarrhoea-predominant IBS (IBS-D) is distinguishable from other IBS-subtypes. In our study, the GI microbiota of IBS-D patients was evaluated and compared with healthy controls (HC) by using a high-resolution sequencing method. The method allowed microbial community analysis on all levels of microbial genomic guanine plus cytosine (G+C) content, including high G+C bacteria. Methods The collective faecal microbiota composition of ten IBS-D patients was analysed by examining sequences obtained using percent G+C (%G+C) -based profiling and fractioning combined with 16S rRNA gene clone library sequencing of 3267 clones. The IBS-D library was compared with an analogous healthy-control library of 23 subjects. Real-time PCR analysis was used to identify phylotypes belonging to the class Gammaproteobacteria and the order Coriobacteriales . Results Significant differences were found between clone libraries of IBS-D patients and controls. The microbial communities of IBS-D patients were enriched in Proteobacteria and Firmicutes , but reduced in the number of Actinobacteria and Bacteroidetes compared to control. In particular, 16S rDNA sequences belonging to the family Lachnospiraceae within the phylum Firmicutes were in greater abundance in the IBS-D clone library. Conclusions In the microbiota of IBS-D sufferers, notable differences were detected among the prominent bacterial phyla ( Firmicutes , Actinobacteria , Bacteroidetes , and Proteobacteria ) localized within the GI tract.

Several publications have described differences in cross-sectional comparisons of gut microbiota between patients with Parkinson's disease and control subjects, with considerable variability of the reported differentially abundant taxa. The temporal stability of such microbiota alterations and their relationship to disease progression have not been previously studied with a high-throughput sequencing based approach.We collected clinical data and stool samples from 64 Parkinson's patients and 64 control subjects twice, on average 2·25 years apart. Disease progression was evaluated based on changes in Unified Parkinson's Disease Rating Scale and Levodopa Equivalent Dose, and microbiota were characterized with 16S rRNA gene amplicon sequencing.We compared patients to controls, and patients with stable disease to those with faster progression. There were significant differences between microbial communities of patients and controls when corrected for confounders, but not between timepoints. Specific bacterial taxa that differed between patients and controls at both timepoints included several previously reported ones, such as Roseburia, Prevotella and Bifidobacterium. In progression comparisons, differentially abundant taxa were inconsistent across methods and timepoints, but there was some support for a different distribution of enterotypes and a decreased abundance of Prevotella in faster-progressing patients.The previously detected gut microbiota differences between Parkinson's patients and controls persisted after 2 years. While we found some evidence for a connection between microbiota and disease progression, a longer follow-up period is required to confirm these findings.

Abstract Background Previous studies have reported that gut microbiota, permeability, short-chain fatty acids (SCFAs), and inflammation are altered in Parkinson’s disease (PD), but how these factors are linked and how they contribute to disease processes and symptoms remains uncertain. This study sought to compare and identify associations among these factors in PD patients and controls to elucidate their interrelations and links to clinical manifestations of PD. Methods Stool and plasma samples and clinical data were collected from 55 PD patients and 56 controls. Levels of stool SCFAs and stool and plasma inflammatory and permeability markers were compared between patients and controls and related to one another and to the gut microbiota. Results Calprotectin was increased and SCFAs decreased in stool in PD in a sex-dependent manner. Inflammatory markers in plasma and stool were neither intercorrelated nor strongly associated with SCFA levels. Age at PD onset was positively correlated with SCFAs and negatively correlated with CXCL8 and IL-1β in stool. Fecal zonulin correlated positively with fecal NGAL and negatively with PD motor and non-motor symptoms. Microbiota diversity and composition were linked to levels of SCFAs, inflammatory factors, and zonulin in stool. Certain relationships differed between patients and controls and by sex. Conclusions Intestinal inflammatory responses and reductions in fecal SCFAs occur in PD, are related to the microbiota and to disease onset, and are not reflected in plasma inflammatory profiles. Some of these relationships are distinct in PD and are sex-dependent. This study revealed potential alterations in microbiota-host interactions and links between earlier PD onset and intestinal inflammatory responses and reduced SCFA levels, highlighting candidate molecules and pathways which may contribute to PD pathogenesis and clinical presentation and which warrant further investigation.