The origins of neural systems remain unresolved. In contrast to other basal metazoans, ctenophores (comb jellies) have both complex nervous and mesoderm-derived muscular systems. These holoplanktonic predators also have sophisticated ciliated locomotion, behaviour and distinct development. Here we present the draft genome of Pleurobrachia bachei, Pacific sea gooseberry, together with ten other ctenophore transcriptomes, and show that they are remarkably distinct from other animal genomes in their content of neurogenic, immune and developmental genes. Our integrative analyses place Ctenophora as the earliest lineage within Metazoa. This hypothesis is supported by comparative analysis of multiple gene families, including the apparent absence of HOX genes, canonical microRNA machinery, and reduced immune complement in ctenophores. Although two distinct nervous systems are well recognized in ctenophores, many bilaterian neuron-specific genes and genes of 'classical' neurotransmitter pathways either are absent or, if present, are not expressed in neurons. Our metabolomic and physiological data are consistent with the hypothesis that ctenophore neural systems, and possibly muscle specification, evolved independently from those in other animals.

The Mollusca are one of the most successful animal phyla — ubiquitous, varied in body plan and with a long fossil record. Their interrelationships have been a matter of debate, but phylogenomic methods are beginning to resolve the issue. A new study answers some questions about the base of the molluscan tree, showing that, contrary to the traditional view, bivalves and gastropods are members of sister taxa. This finding also raises the possibility that centralization of neural and sensory organs in the head region, and the development of protective shells, may have occurred on several occasions in the evolutionary history of the molluscs. Evolutionary relationships among the eight major lineages of Mollusca have remained unresolved despite their diversity and importance. Previous investigations of molluscan phylogeny, based primarily on nuclear ribosomal gene sequences1,2,3 or morphological data4, have been unsuccessful at elucidating these relationships. Recently, phylogenomic studies using dozens to hundreds of genes have greatly improved our understanding of deep animal relationships5. However, limited genomic resources spanning molluscan diversity has prevented use of a phylogenomic approach. Here we use transcriptome and genome data from all major lineages (except Monoplacophora) and recover a well-supported topology for Mollusca. Our results strongly support the Aculifera hypothesis placing Polyplacophora (chitons) in a clade with a monophyletic Aplacophora (worm-like molluscs). Additionally, within Conchifera, a sister-taxon relationship between Gastropoda and Bivalvia is supported. This grouping has received little consideration and contains most (>95%) molluscan species. Thus we propose the node-based name Pleistomollusca. In light of these results, we examined the evolution of morphological characters and found support for advanced cephalization and shells as possibly having multiple origins within Mollusca.

Molecular analyses of Aplysia, a well-established model organism for cellular and systems neural science, have been seriously handicapped by a lack of adequate genomic information. By sequencing cDNA libraries from the central nervous system (CNS), we have identified over 175,000 expressed sequence tags (ESTs), of which 19,814 are unique neuronal gene products and represent 50%–70% of the total Aplysia neuronal transcriptome. We have characterized the transcriptome at three levels: (1) the central nervous system, (2) the elementary components of a simple behavior: the gill-withdrawal reflex—by analyzing sensory, motor, and serotonergic modulatory neurons, and (3) processes of individual neurons. In addition to increasing the amount of available gene sequences of Aplysia by two orders of magnitude, this collection represents the largest database available for any member of the Lophotrochozoa and therefore provides additional insights into evolutionary strategies used by this highly successful diversified lineage, one of the three proposed superclades of bilateral animals.

Abstract Placozoa are small disc-shaped animals, representing the simplest known, possibly ancestral, organization of free-living animals. With only six morphological distinct cell types, without any recognized neurons or muscle, placozoans exhibit fast effector reactions and complex behaviors. However, little is known about electrogenic mechanisms in these animals. Here, we showed the presence of rapid action potentials in four species of placozoans ( Trichoplax adhaerens [H1 haplotype], Trichoplax sp .[H2], Hoilungia hongkongensis [H13], and Hoilungia sp . [H4]). These action potentials are sodium-dependent and can be inducible. The molecular analysis suggests the presence of 5-7 different types of voltage-gated sodium channels, which showed substantial evolutionary radiation compared to many other metazoans. Such unexpected diversity of sodium channels in early-branched animal lineages reflect both duplication events and parallel evolution of unique behavioral integration in these nerveless animals. Highlights Placozoans are the simplest known animals without recognized neurons and muscles With only six morphological cell types, placozoans showed complex & rapid behaviors Sodium-dependent action potentials have been discovered in intact animals Voltage-gated sodium channels (Na v ) in Placozoa support a rapid behavioral integration Placozoans have more Na v channels that any studied invertebrate animal so far Diversification of Na v -channels highlight the unique evolution of these nerveless animals

Abstract ATP and its ionotropic P2X receptors are components of one of the most ancient signaling systems. However, little is known about the distribution and function of purinergic transmission in invertebrates. Here, we cloned, expressed, and pharmacologically characterized P2X receptors in the sea slug Aplysia californica – a prominent model in cellular and system neuroscience. We showed that ATP and P2X receptors are essential signaling components within the unique bioenergetic center located in the CNS of Aplysia , also known as the cerebral F-cluster of insulin-containing neurons. Functional P2X receptors were successfully expressed in Xenopus oocytes to characterize their ATP-dependence (EC 50 =306μM), two-phased kinetics, ion selectivity (Na + -dependence), sensitivity to the ATP analog Bz-ATP (~20% compare to ATP) and antagonists (with PPADS as a more potent inhibitor compared to suramin). Next, using RNA-seq, we characterized the expression of P2X receptors across more than a dozen Aplysia peripheral tissues and developmental stages. We showed that P2X receptors are predominantly expressed in chemosensory structures and during early cleavage stages. The localization and pharmacology of P2X receptors in Aplysia highlight the evolutionary conservation of bioenergetic sensors and chemosensory purinergic transmission across animals. This study also provides a foundation to decipher homeostatic mechanisms in development and neuroendocrine systems. Graphical Abstract We show that ATP and its ligand-gated P2X receptors are essential signaling components within both the chemosensory systems and the unique bioenergetic center, present in the CNS of the sea slug Aplysia californica – a prominent model in neuroscience. Expression and pharmacology of P2X receptors in Aplysia confirms the preservation of evolutionary conserved bioenergetic sensors across animals and provide new tools to decipher homeostatic mechanisms in neuro-endocrine systems in general.

The evolutionary origin of metazoan cell types such as neurons, muscles, digestive, and immune cells, remains unsolved. Using whole-body single-cell RNA sequencing in a sponge, an animal without nervous system and musculature, we identify 18 distinct cell types comprising four major families. This includes nitric-oxide sensitive contractile cells, digestive cells active in macropinocytosis, and a family of amoeboid-neuroid cells involved in innate immunity. We uncover presynaptic genes in an amoeboid-neuroid cell type, and postsynaptic genes in digestive choanocytes, suggesting asymmetric and targeted communication. Corroborating this, long neurite-like extensions from neuroid cells directly contact and enwrap choanocyte microvillar collars. Our data indicate a link between neuroid and immune functions in sponges, and suggest that a primordial neuro-immune system cleared intruders and controlled ciliary beating for feeding.

Abstract ATP and its ionotropic P2X receptors are components of one of the most ancient signaling systems. However, little is known about the distribution and function of purinergic transmission in invertebrates. Here, we cloned, expressed, and pharmacologically characterized P2X receptors in the sea slug Aplysia californica – the prominent model in cellular and system neuroscience. These functional P2X receptors were successfully expressed in Xenopus oocytes and displayed activation by ATP (EC 50 =306 μM) with two-phased kinetics as well as Na + -dependence. The ATP analog, Bz-ATP, was a less effective agonist (~20%) than ATP, and PPADS was a more potent inhibitor of the P2X receptors than the suramin. We showed that P2X receptors are uniquely expressed within Aplysia ’s cerebral bioenergetic center (also known as F-cluster). Using RNA-seq, we found that the F-cluster contains more than a dozen unique secretory peptides, including three insulins, interleukins, and potential toxins, as well as ecdysone-type receptors and a district subset of ion channels. This structure is one of the most prominent integrative centers in the entire CNS and remarkably different from the morphologically similar neurosecretory center (bag cluster) involved in egg-laying behavior. Using RNA-seq, we also characterized the expression of P2X receptors across more than a dozen Aplysia peripheral tissues and developmental stages. We showed that P2X receptors are predominantly expressed in chemosensory structures and during early cleavage stages. The localization and pharmacology of P2X receptors in Aplysia highlight the evolutionary conservation of bioenergetic sensors and chemosensory purinergic transmission across animals. This study also provides a foundation to decipher homeostatic mechanisms in development and neuroendocrine systems. Graphical Abstract We show that ATP and its ligand-gated P2X receptors are essential signaling components within both the chemosensory systems and the unique integrative neurosecretory center, present in the CNS of the sea slug Aplysia – a prominent model in neuroscience. Expression and pharmacology of P2X receptors in Aplysia confirms the preservation of evolutionary conserved bioenergetic sensors across animals and provide new tools to decipher homeostatic mechanisms in neuro-endocrine systems in general.

Abstract D-amino acids are unique and essential signaling molecules in neural, hormonal, and immune systems. However, the presence of D-amino acids and their recruitment in early animals is mostly unknown due to limited information about prebilaterian metazoans. Here, we performed the comparative survey of L-/D-aspartate and L-/D-glutamate in representatives of four phyla of basal Metazoa: cnidarians ( Aglantha ); placozoans ( Trichoplax ), sponges ( Sycon ) and ctenophores ( Pleurobrachia, Mnemiopsis, Bolinopsis , and Beroe ), which are descendants of ancestral animal lineages distinct from Bilateria. Specifically, we used high-performance capillary electrophoresis for microchemical assays and quantification of the enantiomers. L-glutamate and L-aspartate were abundant analytes in all species studied. However, we showed that the placozoans, cnidarians, and sponges had high micromolar concentrations of D-aspartate, whereas D-glutamate was not detectable. In contrast, we found that in ctenophores, D-glutamate was the dominant enantiomer with no or trace amounts of D-aspartate. This situation illuminates prominent lineage-specific diversifications in the recruitment of D-amino acids and suggests distinct signaling functions of these molecules early in the animal evolution. We also hypothesize that a deep ancestry of such recruitment events might provide some constraints underlying the evolution of neural and other signaling systems in Metazoa. Highlights D-amino acids are essential for intercellular signaling and evolution Enantiomers have been quantified in early-branching animals Lineage-specific recruitment of D-glutamate could occur in ctenophores D-aspartate is one of the primary enantiomers in other metazoans Deep ancestry of such events could provide constraints in the evolution of signaling Graphical Abstract D-amino acids are essential for intercellular signaling. Direct microchemical quantification of enantiomers in representatives of early-branching animals suggests lineage-specific recruitments of D-glutamate and D-aspartate. Deep ancestry of such events might provide some constraints underlying the evolution of neural and other signaling systems in Metazoa.

Nitric oxide (NO) is a free radical gaseous messenger with a broad distribution across the animal kingdom. However, the early evolution of nitric oxide-mediated signaling in animals is unclear due to limited information about prebilaterian metazoans such as placozoans. Here, we analyzed NO synthases (NOS) in four different species of placozoans (haplotypes H1, H2, H4, H13). In contrast to all other invertebrates studied, Hoilungia and Trichoplax have three distinct NOS genes, including PDZ domain-containing NOS. To characterize NOS activity in Trichoplax adhaerens, we used capillary electrophoresis for microchemical assays of NO-related metabolites. Specifically, we quantified nitrites (products of NO oxidation) and L-citrulline (co-product of NO synthesis from L-arginine), which were affected by NOS inhibitors confirming the presence of functional NOS. Next, using fluorescent single-molecule in situ hybridization, we showed that distinct NOSs are expressed in different subpopulations of cells, with a noticeable distribution close to the edge regions of Trichoplax. These data suggest the compartmentalized release of this messenger and a greater diversity of cell types in placozoans than anticipated. We also revealed a dramatic diversification of NO receptor machinery, including identification of both canonical and novel NIT-domain containing soluble guanylate cyclases as putative NO/nitrite/nitrate sensors. Thus, although Trichoplax is considered to be one of the morphologically simplest free-living animals, the complexity of NO-cGMP-mediated signaling is greater to those in vertebrates. This situation illuminates multiple lineage-specific diversifications of NOSs and NO/nitrite/nitrate sensors from the common ancestor of Metazoa.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.