Identifying single-cell types in the mouse brain The recent development of single-cell genomic techniques allows us to profile gene expression at the single-cell level easily, although many of these methods have limited throughput. Rosenberg et al. describe a strategy called split-pool ligation-based transcriptome sequencing, or SPLiT-seq, which uses combinatorial barcoding to profile single-cell transcriptomes without requiring the physical isolation of each cell. The authors used their method to profile >100,000 single-cell transcriptomes from mouse brains and spinal cords at 2 and 11 days after birth. Comparisons with in situ hybridization data on RNA expression from Allen Institute atlases linked these transcriptomes with spatial mapping, from which developmental lineages could be identified. Science , this issue p. 176

Abstract Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) has become a core tool for researchers to understand biology. As scRNA-seq has become more ubiquitous, many applications demand higher scalability and sensitivity. Split-pool combinatorial barcoding makes it possible to scale projects to hundreds of samples and millions of cells, overcoming limitations of previous droplet based technologies. However, there is still a need for increased sensitivity for both droplet and combinatorial barcoding based scRNA-seq technologies. To meet this need, here we introduce an updated combinatorial barcoding method for scRNA-seq with dramatically improved sensitivity. To assess performance, we profile a variety of sample types, including cell lines, human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), mouse brain nuclei, and mouse liver nuclei. When compared to the previously best performing approach, we find up to a 2.6-fold increase in unique transcripts detected per cell and up to a 1.8-fold increase in genes detected per cell. These improvements to transcript and gene detection increase the resolution of the resulting data, making it easier to distinguish cell types and states in heterogeneous samples. Split-pool combinatorial barcoding already enables scaling to millions of cells, the ability to perform scRNA-seq on previously fixed and frozen samples, and access to scRNA-seq without the need to purchase specialized lab equipment. Our hope is that by combining these previous advantages with the dramatic improvements to sensitivity presented here, we will elevate the standards and capabilities of scRNA-seq for the broader community.

Summary We present a quantitative co-analysis of RNA abundance and sarcomere organization in single cells and an integrated framework to predict subcellular organization states from gene expression. We used human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiomyocytes expressing mEGFP-tagged alpha-actinin-2 to develop quantitative image analysis tools for systematic and automated classification of subcellular organization. This captured a wide range of sarcomeric organization states within cell populations that were previously difficult to quantify. We performed RNA FISH targeting genes identified by single cell RNA sequencing to simultaneously assess the relationship between transcript abundance and structural states in single cells. Co-analysis of gene expression and sarcomeric patterns in the same cells revealed biologically meaningful correlations that could be used to predict organizational states. This study establishes a framework for multi-dimensional analysis of single cells to study the relationships between gene expression and subcellular organization and to develop a more nuanced description of cell states. Graphical Abstract Transcriptional profiling and structural classification was performed on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to characterize the relationship between transcript abundance and subcellular organization.

ABSTRACT Cerebellar development and function require precise regulation of molecular and cellular programs to coordinate motor functions and integrate network signals required for cognition and emotional regulation. However, molecular understanding of human cerebellar development is limited. Here, we combined spatially resolved and single-cell transcriptomics to systematically map the molecular, cellular, and spatial composition of early and mid-gestational human cerebellum. This enabled us to transcriptionally profile major cell types and examine the dynamics of gene expression within cell types and lineages across development. The resulting ‘Developmental Cell Atlas of the Human Cerebellum’ demonstrates that the molecular organization of the cerebellar anlage reflects cytoarchitecturally distinct regions and developmentally transient cell types that are insufficiently captured in bulk transcriptional profiles. By mapping disease genes onto cell types, we implicate the dysregulation of specific cerebellar cell types, especially Purkinje cells, in pediatric and adult neurological disorders. These data provide a critical resource for understanding human cerebellar development with implications for the cellular basis of cerebellar diseases.

Abstract We performed a comprehensive analysis of the transcriptional changes within and across cell populations during human induced pluripotent stem cell (hiPSC) differentiation to cardiomyocytes. Using the single cell RNA-seq combinatorial barcoding method SPLiT-seq, we sequenced >20,000 single cells from 55 independent samples representing two differentiation protocols and multiple hiPSC lines. Samples included experimental replicates ranging from undifferentiated hiPSCs to mixed populations of cells at D90 post-differentiation. As expected, differentiated cell populations clustered by time point, with differential expression analysis revealing markers of cardiomyocyte differentiation and maturation changing from D12 to D90. We next performed a complementary cluster-independent sparse regression analysis to identify and rank genes that best assigned cells to differentiation time points. The two highest ranked genes between D12 and D24 ( MYH7 and MYH6 ) resulted in an accuracy of 0.84, and the three highest ranked genes between D24 and D90 ( A2M, H19, IGF2 ) resulted in an accuracy of 0.94, revealing that low dimensional gene features can identify differentiation or maturation stages in differentiating cardiomyocytes. Expression levels of select genes were validated using RNA FISH. Finally, we interrogated differences in differentiation population composition and cardiac gene expression resulting from two differentiation protocols, experimental replicates, and three hiPSC lines in the WTC-11 background to identify sources of variation across these experimental variables.

Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) has become an essential tool for characterizing multi-celled eukaryotic systems but current methods are not compatible with bacteria. Here, we introduce microSPLiT, a low cost and high-throughput scRNA-seq method that works for gram-negative and gram-positive bacteria and can resolve transcriptional states that remain hidden at a population level. We applied microSPLiT to >25,000 Bacillus subtilis cells sampled from different growth stages, creating a detailed atlas of changes in metabolism and lifestyle. We not only retrieve detailed gene expression profiles associated with known but rare states such as competence and PBSX prophage induction, but also identify novel and unexpected gene expression states including heterogeneous activation of a niche metabolic pathway in a subpopulation of cells. microSPLiT empowers high-throughput analysis of gene expression in complex bacterial communities.

Constructing an atlas of cell types in complex organisms will require a collective effort to characterize billions of individual cells. Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) has emerged as the main tool for characterizing cellular diversity, but current methods use custom microfluidics or microwells to compartmentalize single cells, limiting scalability and widespread adoption. Here we present Split Pool Ligation-based Transcriptome sequencing (SPLiT-seq), a scRNA-seq method that labels the cellular origin of RNA through combinatorial indexing. SPLiT-seq is compatible with fixed cells, scales exponentially, uses only basic laboratory equipment, and costs one cent per cell. We used this approach to analyze 109,069 single cell transcriptomes from an entire postnatal day 5 mouse brain, providing the first global snapshot at this stage of development. We identified 13 main populations comprising different types of neurons, glia, immune cells, endothelia, as well as types in the blood-brain-barrier. Moreover, we resolve substructure within these clusters corresponding to cells at different stages of development. As sequencing capacity increases, SPLiT-seq will enable profiling of billions of cells in a single experiment.