Abstract Transcriptional and epigenetic profiling of single-cells has advanced our knowledge of the molecular bases of gastrulation and early organogenesis. However, current approaches rely on dissociating cells from tissues, thereby losing the crucial spatial context that is necessary for understanding cell and tissue interactions during development. Here, we apply an image-based single-cell transcriptomics method, seqFISH, to simultaneously and precisely detect mRNA molecules for 387 selected target genes in 8-12 somite stage mouse embryo tissue sections. By integrating spatial context and highly multiplexed transcriptional measurements with two single-cell transcriptome atlases we accurately characterize cell types across the embryo and demonstrate how spatially-resolved expression of genes not profiled by seqFISH can be imputed. We use this high-resolution spatial map to characterize fundamental steps in the patterning of the midbrain-hindbrain boundary and the developing gut tube. Our spatial atlas uncovers axes of resolution that are not apparent from single-cell RNA sequencing data – for example, in the gut tube we observe early dorsal-ventral separation of esophageal and tracheal progenitor populations. In sum, by computationally integrating high-resolution spatially-resolved gene expression maps with single-cell genomics data, we provide a powerful new approach for studying how and when cell fate decisions are made during early mammalian development.

ABSTRACT Currently available single cell -omics technologies capture many unique features with different biological information content. Data integration aims to place cells, captured with different technologies, onto a common embedding to facilitate downstream analytical tasks. Current horizontal data integration techniques use a set of common features, thereby ignoring non-overlapping features and losing information. Here we introduce StabMap, a mosaic data integration technique that stabilises mapping of single cell data by exploiting the non-overlapping features. StabMap is a flexible approach that first infers a mosaic data topology, then projects all cells onto supervised or unsupervised reference coordinates by traversing shortest paths along the topology. We show that StabMap performs well in various simulation contexts, facilitates disjoint mosaic data integration, and enables the use of novel spatial gene expression features for mapping dissociated single cell data onto a spatial transcriptomic reference.

Abstract Summary SpatialExperiment is a new data infrastructure for storing and accessing spatially resolved transcriptomics data, implemented within the R/Bioconductor framework, which provides advantages of modularity, interoperability, standardized operations, and comprehensive documentation. Here, we demonstrate the structure and user interface with examples from the 10x Genomics Visium and seqFISH platforms, and provide access to example datasets and visualization tools in the STexampleData , TENxVisiumData , and ggspavis packages. Availability and Implementation The SpatialExperiment , STexampleData , TENxVisiumData , and ggspavis packages are available from Bioconductor. The package versions described in this manuscript are available in Bioconductor version 3.15 onwards. Contact risso.davide@gmail.com , shicks19@jhu.edu Supplementary Information Supplementary Tables and Figures are available online.

ABSTRACT Single-cell RNA-sequencing has transformed our ability to examine cell fate choice. For example, in the context of development and differentiation, computational ordering of cells along ‘pseudotime’ enables the expression profiles of individual genes, including key transcription factors, to be examined at fine scale temporal resolution. However, while cell fate decisions are typically marked by profound changes in expression, many such changes are observed in genes downstream of the initial cell fate decision. By contrast, the genes directly involved in the cell fate decision process are likely to interact in subtle ways, potentially resulting in observed changes in patterns of correlation and variation rather than mean expression prior to cell fate commitment. Herein, we describe a novel approach, scHOT – single cell Higher Order Testing - which provides a flexible and statistically robust framework for identifying changes in higher order interactions among genes. scHOT is general and modular in nature, can be run in multiple data contexts such as along a continuous trajectory, between discrete groups, and over spatial orientations; as well as accommodate any higher order measurement such as variability or correlation. We demonstrate the utility of scHOT by studying embryonic development of the liver, where we find coordinated changes in higher order interactions of programs related to differentiation and liver function. We also demonstrate its ability to find subtle changes in gene-gene correlation patterns across space using spatially-resolved expression data from the mouse olfactory bulb. scHOT meaningfully adds to first order effect testing, such as differential expression, and provides a framework for interrogating higher order interactions from single cell data.

Abstract Background Single cell technologies are transforming biomedical research, including the recent demonstration that unspliced pre-mRNA present in single cell RNA-Seq permits prediction of future expression states. Here we applied this ‘RNA velocity concept’ to an extended timecourse dataset covering mouse gastrulation and early organogenesis. Results Intriguingly, RNA velocity correctly identified epiblast cells as the starting point, but several trajectory predictions at later stages were inconsistent with both real time ordering and existing knowledge. The most striking discrepancy concerned red blood cell maturation, with velocity-inferred trajectories opposing the true differentiation path. Investigating the underlying causes revealed a group of genes with a coordinated step-change in transcription, thus violating the assumptions behind current velocity analysis suites, which do not accommodate time-dependent changes in expression dynamics. Using scRNA-Seq analysis of chimeric mouse embryos lacking the major erythroid regulator Gata1 , we show that genes with the step-changes in expression dynamics during erythroid differentiation fail to be up-regulated in the mutant cells, thus underscoring the coordination of modulating transcription rate along a differentiation trajectory. In addition to the expected block in erythroid maturation, the Gata1 - chimera dataset revealed induction of PU.1 and expansion of megakaryocyte progenitors. Finally, we show that erythropoiesis in human fetal liver is similarly characterized by a coordinated step-change in gene expression. Conclusions By identifying a limitation of the current velocity framework coupled with in vivo analysis of mutant cells, we reveal a coordinated step-change in gene expression kinetics during erythropoiesis, with likely implications for many other differentiation processes.

Abstract Recent advances in subcellular imaging transcriptomics platforms have enabled high-resolution spatial mapping of gene expression, while also introducing significant analytical challenges in accurately identifying cells and assigning transcripts. Existing methods grapple with cell segmentation, frequently leading to fragmented cells or oversized cells that capture contaminated expression. To this end, we present BIDCell, a self-supervised deep learning-based framework with biologically-informed loss functions that learn relationships between spatially resolved gene expression and cell morphology. BIDCell incorporates cell-type data, including single-cell transcriptomics data from public repositories, with cell morphology information. Using a comprehensive evaluation framework consisting of metrics in five complementary categories for cell segmentation performance, we demonstrate that BIDCell outperforms other state-of-the-art methods according to many metrics across a variety of tissue types and technology platforms. Our findings underscore the potential of BIDCell to significantly enhance single-cell spatial expression analyses, including cell-cell interactions, enabling great potential in biological discovery.

Abstract With the rapid development of computational methods for single-cell sequencing data, benchmarking serves a valuation resource. As the number of benchmarking studies surges, it is timely to assess the current state of the field. We conducted a systematic literature search and assessed 245 papers, including all 95 benchmark-only papers from the search and an additional 150 method development papers containing benchmarking. This collective effort provides the most comprehensive quantitative summary of the current landscape of single-cell benchmarking studies. We examine performances across nine broad categories, including often ignored aspects such as role of datasets, robustness of methods and downstream evaluation. Our analysis highlights challenges such as how to effectively combine knowledge across multiple benchmarking studies and in what ways can the community recognise the risk and prevent benchmarking fatigue. This paper highlights the importance of adopting a community-led research paradigm to tackle these challenges and establish best practice standards.

Genetic and environmental factors play a major role in metabolic health. However, they do not act in isolation, as a change in an environmental factor such as diet may exert different effects based on an individual’s genotype. Here, we sought to understand how such gene-diet interactions influenced nutrient storage and utilisation, a major determinant of metabolic disease. We subjected the Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP), comprising 200 genetically divergent inbred fly strains, to diets varying in sugar, fat and protein. We assessed starvation resistance, a holistic phenotype of nutrient storage and utilisation that can be robustly measured. Diet influenced the starvation resistance of each strain, but this effect varied markedly between strains. This demonstrates that genetics plays a major role in the response to diet. Furthermore, heritability analysis revealed that the greatest variability arose from diets either high in sugar or high in protein. To uncover the genetic underpinnings of this variation, we mapped 1,239 diet-responsive SNPs in 534 genes, 325 of which have human orthologues. Using whole-body knockdown, we confirmed that 30 candidate genes were required for glucose tolerance, storage and utilization. In particular, we characterised CG4607, a GLUT6/GLUT8 homolog, as a key protein involved in sugar tolerance. Overall, this provides strong evidence that genetics is a major contributor to how individuals respond to diets of varying nutrient composition. It is likely that a similar principle may be applied to metabolic disease in higher organisms thus supporting the case for nutrigenomics as an important health strategy.

Hepatocellular Carcinoma (HCC) is a type of malignant solid tumor, causing high morbidity and mortality around the world and the major portion of HCC patients is from China. Cancer immunotherapies have shown some clinical responses in treating some types of cancer but did not shown significant efficiency in HCC treatment. This in part due to the impact of immune cells in the tumor microenvironment. It is commonly believed that HCC is a heterogeneous solid tumor and the microenvironment of HCC plays an important role in tumorgenesis and development. Currently, the residents of the microenvironment of HCC is not well-defined and clarification, especially the immune cells, which we believe that paly pivotal roles in tumorgenesis and development. To depict the landscape of the composition, lineage and functional states of the immune cells in HCC, we performed single-cell RNA sequencing on Diethylnitrosamine (DEN)-induced mouse HCC model. We observed heterogeneity within the immune and hepatocytes both in the precancerous condition of tumorigenesis and cancerous condition of HCC. In this study we found that the disease-associated changes appeared early in pathological progression and were highly cell-type specific. Specific subsets of T and B cells preferentially enriched in HCC, and we identified signature genes for each subset. Additionally, we mapped this group of specific cells to the human TCGA database. We found a cluster of naive B cells characterized by high expression of CD38 associated with better prognosis of human HCC. Our study demonstrates signaling interaction map based on receptor-ligand bonding on the single-cell level could broaden our comprehending of cellular networks in varies status. Our finding provides a new approach for patient stratification and will help further understand the functional states, dynamics and signaling interaction of B cells in hepatocellular carcinoma, and may provide a novel insight and therapeutics for the HCC.

Genes act as a system and not in isolation. Thus, it is important to consider coordinated changes of gene expression rather than single genes when investigating biological phenomena such as the aetiology of cancer. We have developed an approach for quantifying how changes in the association between pairs of genes may inform patient prognosis called Differential Correlation across Ranked Samples (DCARS). Modelling gene correlation across a continuous sample ranking does not require the classification of patients into 'good' or 'poor' prognosis groups and can identify differences in gene correlation across early, mid or late stages of survival outcome. When we evaluated DCARS against the typical Fisher Z-transformation test for differential correlation, as well as a typical approach testing for interaction within a linear model, on real TCGA data, DCARS significantly ranked gene pairs containing known cancer genes more highly across a number of cancers. Similar results are found with our simulation study. DCARS was applied to 13 cancers datasets in TCGA, revealing a number of distinct relationships for which survival ranking was found to be associated with a change in correlation between genes. Furthermore, we demonstrated that DCARS can be used in conjunction with network analysis techniques to extract biological meaning from multi- layered and complex data.