Abstract Although evolution is historically considered a slow, gradual process, it is now clear that evolution can occur rapidly over generational timescales. It remains unclear both how predictable rapid evolution is and what timescales are ecologically relevant due to a paucity of longitudinal studies. We use a common garden approach to measure genetic-based change in complex, fitness-associated traits that are important for climatic adaptation in wild Drosophila over multiple timescales: an estimated 1-16 generations within each year and 48-89 generations over five consecutive years. Evolution is fast and pervasive with parallel patterns of rapid evolution in three distinct locations that span 4º latitude. Developmental time evolves consistently across seasons with flies collected in spring developing faster than those collected in autumn. The evolutionary trajectory of stress traits (heat knockdown and starvation) depends on the severity of the preceding winter: harsh winters result in a predictable evolutionary trajectory with high stress tolerance in spring flies that declines in the subsequent generations across the summer. Flies collected after mild winters do not evolve in a predictable pattern but may utilize an alternative strategy as plasticity for chill coma recovery and starvation evolves across seasons. Overall, winter severity determines the predictability of rapid seasonal evolution, but there are also long-term shifts in the phenotypic correlations and allele frequencies that indicate long-term population changes that have broader implications for how organisms respond to the changing climate. Significance Statement Adaptive tracking may result in rapid evolution over short timescales, but the repeatability and predictability of rapid adaptation is less well resolved without long-term, multi-year analyses. Here, we collect wild flies at regular intervals across five years to determine what traits evolve consistently over seasons and which environmental variables predict this rapid evolution. Traditional temperate seasonal patterns of harsh winters are crucial for normal selection patterns, although independently changing phenotypic and genetic correlations help the populations respond to long-term shifts over years, particularly in response to heat stress. This has the implication that populations may be flexible within certain genetic constraints to adapt to changing climatic temperatures.

Finding the specific nucleotides that underlie adaptive variation is a major goal in evolutionary biology, but polygenic traits pose a challenge because the complex genotype-phenotype relationship can obscure the effects of individual alleles. However, natural selection working in large wild populations can shift allele frequencies and indicate functional regions of the genome. Previously, we showed that the two most common alleles of a complex amino acid insertion-deletion polymorphism in the Drosophila insulin receptor show independent, parallel clines in frequency across the North American and Australian continents. Here, we report that the cline is stable over at least a five-year period and that the polymorphism also demonstrates temporal shifts in allele frequency concurrent with seasonal change. We tested the alleles for effects on levels of insulin signaling, fecundity, development time, body size, stress tolerance, and lifespan. We find that the alleles are associated with predictable differences in these traits, consistent with patterns of Drosophila life history variation across geography that likely reflect adaptation to the heterogeneous climatic environment. These results implicate insulin signaling as a major mediator of life history adaptation in Drosophila , and suggest that life history tradeoffs can be explained by extensive pleiotropy at a single locus.

Abstract Background Many Drosophila species use acoustic communication during courtship and studies of these communication systems have provided insight into neurobiology, behavioral ecology, ethology, and evolution. Recording Drosophila courtship sounds and associated behavior is challenging, especially at high throughput, and previously designed devices are relatively expensive and complex to assemble. Results We present construction plans for a modular system utilizing mostly off-the-shelf, relatively inexpensive components that provides simultaneous high-resolution audio and video recording of 96 isolated or paired Drosophila individuals. We provide open-source control software to record audio and video. We designed high intensity LED arrays that can be used to perform optogenetic activation and inactivation of labelled neurons. The basic design can be modified to facilitate novel study designs or to record insects larger than Drosophila . Fewer than 96 microphones can be used in the system if the full array is not required or to reduce costs. Implications Our hardware design and software provide an improved platform for reliable and comparatively inexpensive high-throughput recording of Drosophila courtship acoustic and visual behavior and perhaps for recording acoustic signals of other small animals.

Learning is a general mechanism of adaptive behavioural plasticity whose benefits and costs depend on the environment. Thus, seasonal oscillations in temperate environments between winter and summer might produce cyclical selection pressures that would drive rapid evolution of learning performance in multivoltine populations. To test this hypothesis, we investigated the evolutionary dynamics of learning ability over this rapid seasonal timescale in a natural population of Drosophila melanogaster . Associative learning was tested in common garden-raised flies collected from nature in the spring and fall over three consecutive years. The spring flies consistently learned better than fall flies, revealing seasonal evolution of improved learning performance in nature. Fecundity showed the opposite seasonal pattern, suggesting a trade-off between learning and reproduction. This trade-off also held within population: more fecund individual females learned less well. This trade-off is mediated at least in part by natural polymorphism in the RNA binding protein couch potato ( cpo ), with a genotype favoured during summer showing poorer learning performance and higher fecundity than a genotype favoured over winter. Thus, seasonal environments can drive rapid cyclical evolution of learning performance, but the evolutionary dynamics may be driven by trade-offs generated by pleiotropic effects of causative alleles selected for other reasons.

Abstract Homology-directed repair (HDR) is a powerful tool for modifying genomes in precise ways to address many biological questions. Use of Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9 induced targeted DNA double-strand breakage has substantially simplified use of homology-directed repair to introduce specific perturbations in Drosophila , but existing platforms for CRISPR-Cas9-mediated HDR in Drosophila involve multiple cloning steps and have low efficiency. To simplify cloning of HDR plasmids, we designed a new plasmid platform, the Janelia Atalanta (pJAT) series, that exploits recent advances in dsDNA synthesis to facilitate Gateway cloning of gRNA sequences and homology arms in one step. Surprisingly, the pJAT plasmids yielded considerably higher HDR efficiency (approximately 25%) than we have observed with other approaches. pJAT plasmids work in multiple Drosophila species and exhibited such high efficiency that previously impossible experiments in Drosophila , such as driving targeted chromosomal inversions, were made possible. We provide pJAT plasmids for a range of commonly performed experiments including targeted insertional mutagenesis, insertion of phiC31-mediated attP landing sites, generation of strains carrying a germ-line source of Cas9, and induction of chromosomal rearrangements. We also provide “empty” pJAT plasmids with multiple cloning sites to simplify construction of plasmids with new functionality. The pJAT platform is generic and may facilitate improved efficiency CRISPR-Cas9 HDR in a wide range of model and non-model organisms.

Understanding the rate of evolutionary change and the genetic architecture that facilitates rapid adaptation is a current challenge in evolutionary biology. Comparative studies show that genes with immune function are among the most rapidly evolving genes in a range of taxa. Here, we use immune defense in natural populations of D. melanogaster to understand the rate of evolution in natural populations and the genetics underlying the rapid change. We probed the immune system using the natural pathogens Enterococcus faecalis and Providencia rettgeri to measure post-infection survival and bacterial load of wild D. melanogaster populations collected across seasonal time along a latitudinal transect on the eastern North America (Massachusetts, Pennsylvania, and Virginia). There are pronounced and repeatable changes in the immune response over approximately 10 generations between the spring and fall populations with a significant but less distinct difference among geographic locations. Genes with known immune function are not enriched among alleles that cycle with seasonal time, but the immune function of a subset of seasonally cycling alleles in immune genes was tested using reconstructed outbred populations. We find that flies containing seasonal alleles in Thioester-containing protein 3 (Tep3) have different functional responses to infection and that epistatic interactions among seasonal Tep3 and Drosomycin-like 6 (Dro6) alleles produce the immune phenotypes observed in natural populations. This rapid, cyclic response to seasonal environmental pressure broadens our understanding of the complex ecological and genetic interactions determining the evolution of immune defense in natural populations.

To advance our understanding of adaptation to temporally varying selection pressures, we identified signatures of seasonal adaptation occurring in parallel among Drosophila melanogaster populations. To study these evolutionary dynamics, we estimated allele frequencies genome-wide from flies sampled early and late in the growing season from 20 widely dispersed populations. We identify parallel seasonal allele frequency shifts across North America and Europe, demonstrating that seasonal adaptation is a general phenomenon of temperate fly populations. The direction of allele frequency change at seasonally variable polymorphisms can be predicted by weather conditions in the weeks prior to sampling, linking the environment and the genomic response to selection. The extent of allele frequency fluctuations implies that seasonal evolution drives substantial (5-10%) allele frequency fluctuations at >1% of common polymorphisms across the genome. Our results suggest that fluctuating selection is an important evolutionary force affecting the extent and stability of linked and functional variation.

Abstract Drosophila melanogaster is a leading model in population genetics and genomics, and a growing number of whole-genome datasets from natural populations of this species have been published over the last 20 years. A major challenge is the integration of these disparate datasets, often generated using different sequencing technologies and bioinformatic pipelines, which hampers our ability to address questions about the evolution and population structure of this species. Here we address these issues by developing a bioinformatics pipeline that maps pooled sequencing (Pool-Seq) reads from D. melanogaster to a hologenome consisting of fly and symbiont genomes and estimates allele frequencies using either a heuristic (PoolSNP) or a probabilistic variant caller (SNAPE-pooled). We use this pipeline to generate the largest data repository of genomic data available for D. melanogaster to date, encompassing 271 population samples from over 100 locations in >20 countries on four continents based on a combination of 121 unpublished and 150 previously published genomic datasets. Several of these locations have been sampled at different seasons across multiple years. This dataset, which we call Drosophila Evolution over Space and Time (DEST), is coupled with sampling and environmental meta-data. A web-based genome browser and web portal provide easy access to the SNP dataset. Our aim is to provide this scalable platform as a community resource which can be easily extended via future efforts for an even more extensive cosmopolitan dataset. Our resource will enable population geneticists to analyze spatio-temporal genetic patterns and evolutionary dynamics of D. melanogaster populations in unprecedented detail.