ABSTRACT Background & Aims Transcription termination fine tunes gene expression and contributes to specify the function of RNAs in eukaryotic cells. Transcription termination of hepatitis B virus (HBV) is subjected to the recognition of the canonical polyadenylation signal (cPAS) common to all viral transcripts. The regulation of the usage of this cPAS and its impact on viral gene expression and replication is currently unknown. Approach & Results To unravel the regulation of HBV transcript termination, we implemented a 3’ RACE-PCR assay coupled to single molecule sequencing both in in vitro infected hepatocytes and in chronically infected patients. The detection of a previously unidentified transcriptional readthrough indicated that the cPAS was not systematically recognized during HBV replication in vitro and in vivo . Gene expression downregulation experiments demonstrated a role for the RNA helicases DDX5 and DDX17 in promoting viral transcriptional readthrough, which was, in turn, associated to HBV RNA destabilization and decreased HBx protein expression. RNA and chromatin immunoprecipitation, together with mutation of cPAS sequence suggested a direct role of DDX5 and DDX17 in functionally linking cPAS recognition to transcriptional readthrough, HBV RNA stability and replication. Conclusions Our findings identify DDX5 and DDX17 as crucial determinants for HBV transcriptional fidelity and as host restriction factors for HBV replication.

Abstract DEAD box helicases DDX17 and DDX5 control the termination of transcription and the associated cleavage of the 3’ end of transcripts. Here we show that the transcriptional readthrough induced by their depletion in neuroblastoma cells also results in increased production of chimeric transcripts from tandemly oriented genes. Analysis of neuroblastoma tumours in which chimeric transcripts are abundant revealed that low expression of the DDX17 and DDX5 genes is associated with poor overall patient survival. Low DDX17 expression is also significantly associated with high-risk tumours and is inversely correlated with MYCN oncogene amplification, suggesting a link between these two factors. We demonstrate that changes in MYCN expression do not affect the expression of either helicase, but alter transcription termination leading to the production of chimeric transcripts. We provide evidence that MYCN acts on termination through its direct binding to the 3’ region of genes and that it interacts with DDX17, suggesting that it may inhibit the activity of the helicase. Collectively, our work reveals a novel function of MYCN in transcription termination and suggests that the deregulation of MYCN and DDX17/DDX5 expression in neuroblastoma may lead to the expression of non-canonical and potentially harmful RNA molecules.

BackgroundCirculating HBV RNAs have been proposed as a biomarker that reflects the transcriptional activity of cccDNA and may help to evaluate HBV treatments activity. Different research assays have been proposed and, although 2 PCR-based research use only (RUO) investigational assays (IA) have been developed, the lack of standardized protocols represents an important limitation. Here we have designed and generated a stable clonal cell line producing an RNA-based standard for the calibration of PCR-based circulating HBV RNA assays.MethodsHBV RNA producing Huh7-derived stable cell lines were generated by transfecting pTriEX plasmids containing 1.1 length HBV DNA genomes carrying mutations in the catalytic site (YMAA mutation) and the TP-domain (Y63F) of the polymerase, and the ε-loop of the pgRNA (mutation A1G).ResultsThe clonal cell line (Huh7-3D29), carrying a double YMAA and Y63F mutation, displayed, and maintained over several passages in culture, a high RNA secretion phenotype with negligible residual secreted HBV DNA. Density gradient centrifugation showed that most of the secreted HBV RNA from Huh7-3D29 cells was detected in naked capsid and virions-like particles and only a minority in small extracellular vescicles (sEV). Nanopore sequencing of 5'RACE products shows that the majority of the Huh7-3D29 secreted HBV RNAs start at the 5' end of pgRNA and pgRNA derived spliced RNAs. Finally, Huh7-3D29 cells showed a high and up-scalable secreted RNA yield allowing 1,300 standard curves in 9 days from 1 flask.ConclusionWe generated a clonal cell line that produces high amounts of HBV RNAs with very low quantities of contaminating HBV DNAs, representing a stable source of RNA standard for HBV RNA assays calibration.Impact and ImplicationsSeveral investigational assays and 2 research use only (RUO) assays have been developed to detect and quantify circulating HBV RNAs, an emerging biomarker of cccDNA transcriptional activity and target engagement by new HBV treatments. The lack of a unique molecular standard for circulating HBV RNAs quantification represents an important limitation. Here we describe the generation of a stable clonal cell line producing and secreting an RNA-based standard containing all the HBV RNA species found in HBV patients' sera (e.g., pgRNA, HBx transcripts). This new RNA standard will serve for the calibration of all PCR-based assays for circulating HBV RNA quantification to evaluate in a non-invasive manner the size of the transcriptionally active cccDNA pool and the activity of novel strategies aiming at curing HBV infection.