Sequencing the transcriptomes of more than 100 species of alga yields new channelrhodopsins with promising properties for optogenetics. A far red–shifted channelrhodopsin, Chrimson, opens up new behavioral capabilities in Drosophila, and alongside a fast yet light-sensitive blue channelrhodopsin, Chronos, enables independent excitation of two neuronal populations in brain slices. Optogenetic tools enable examination of how specific cell types contribute to brain circuit functions. A long-standing question is whether it is possible to independently activate two distinct neural populations in mammalian brain tissue. Such a capability would enable the study of how different synapses or pathways interact to encode information in the brain. Here we describe two channelrhodopsins, Chronos and Chrimson, discovered through sequencing and physiological characterization of opsins from over 100 species of alga. Chrimson's excitation spectrum is red shifted by 45 nm relative to previous channelrhodopsins and can enable experiments in which red light is preferred. We show minimal visual system–mediated behavioral interference when using Chrimson in neurobehavioral studies in Drosophila melanogaster. Chronos has faster kinetics than previous channelrhodopsins yet is effectively more light sensitive. Together these two reagents enable two-color activation of neural spiking and downstream synaptic transmission in independent neural populations without detectable cross-talk in mouse brain slice.

An increasingly powerful approach for studying brain circuits relies on targeting genetically encoded sensors and effectors to specific cell types. However, current approaches for this are still limited in functionality and specificity. Here we utilize several intersectional strategies to generate multiple transgenic mouse lines expressing high levels of novel genetic tools with high specificity. We developed driver and double reporter mouse lines and viral vectors using the Cre/Flp and Cre/Dre double recombinase systems and established a new, retargetable genomic locus, TIGRE, which allowed the generation of a large set of Cre/tTA-dependent reporter lines expressing fluorescent proteins, genetically encoded calcium, voltage, or glutamate indicators, and optogenetic effectors, all at substantially higher levels than before. High functionality was shown in example mouse lines for GCaMP6, YCX2.60, VSFP Butterfly 1.2, and Jaws. These novel transgenic lines greatly expand the ability to monitor and manipulate neuronal activities with increased specificity.Video AbstracteyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiI2NTYzNzNhZmE2MGI5NWI4ZDE3MjNlY2RlZjk0MzdiYSIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjc4MjY4MTM1fQ.PpjP_UHxkXdfCILXG8d3N5UMZym6WxE2Z7K3TBjmFJmC2rZ3MBLSzsdT85oNLYywZQOSEZ4UA2jXN6uPv2rVb5zQ-JMRrufAMnsg3E-Pa3NnLoEkenYA0lM656zzJND7RmRc429iikBmxLG7h0arfreFHtS7lOVlZVZHlWAWIDIoJQmh7OH3qSPYn1wRmIZiX_38btOYd4VvUxYz3qm4IrgWvwJvCUDPELE3AUdoVDjuqScKc8QqfZv216980RgtlUaNmEH1U05Rmu_z9NaI0idxfHJRD4LdL7lfDTB3qJVj-d6X7ddVHyQ3ElqlMRSUg6hqyg0MRGbP6yxtIBVIkA(mp4, (34.59 MB) Download video

A combination of a sensitive blue light–gated channelrhodopsin actuator and red-shifted Arch-based voltage sensors allows all-optical electrophysiology without cross-talk in cultured neurons or brain slices. All-optical electrophysiology—spatially resolved simultaneous optical perturbation and measurement of membrane voltage—would open new vistas in neuroscience research. We evolved two archaerhodopsin-based voltage indicators, QuasAr1 and QuasAr2, which show improved brightness and voltage sensitivity, have microsecond response times and produce no photocurrent. We engineered a channelrhodopsin actuator, CheRiff, which shows high light sensitivity and rapid kinetics and is spectrally orthogonal to the QuasArs. A coexpression vector, Optopatch, enabled cross-talk–free genetically targeted all-optical electrophysiology. In cultured rat neurons, we combined Optopatch with patterned optical excitation to probe back-propagating action potentials (APs) in dendritic spines, synaptic transmission, subcellular microsecond-timescale details of AP propagation, and simultaneous firing of many neurons in a network. Optopatch measurements revealed homeostatic tuning of intrinsic excitability in human stem cell–derived neurons. In rat brain slices, Optopatch induced and reported APs and subthreshold events with high signal-to-noise ratios. The Optopatch platform enables high-throughput, spatially resolved electrophysiology without the use of conventional electrodes.

In this Technical Report, Chuong and colleagues introduce Jaws, an archaeon-derived, photoactivatable chloride pump that responds to red light. Owing to its efficiency in absorbing red photons and its large photocurrent, Jaws can be transcranially activated deep in the brain and thus allows noninvasive optogenetic silencing. Optogenetic inhibition of the electrical activity of neurons enables the causal assessment of their contributions to brain functions. Red light penetrates deeper into tissue than other visible wavelengths. We present a red-shifted cruxhalorhodopsin, Jaws, derived from Haloarcula (Halobacterium) salinarum (strain Shark) and engineered to result in red light–induced photocurrents three times those of earlier silencers. Jaws exhibits robust inhibition of sensory-evoked neural activity in the cortex and results in strong light responses when used in retinas of retinitis pigmentosa model mice. We also demonstrate that Jaws can noninvasively mediate transcranial optical inhibition of neurons deep in the brains of awake mice. The noninvasive optogenetic inhibition opened up by Jaws enables a variety of important neuroscience experiments and offers a powerful general-use chloride pump for basic and applied neuroscience.

Technologies for silencing the electrical activity of genetically targeted neurons in the brain are important for assessing the contribution of specific cell types and pathways toward behaviors and pathologies. Recently we found that archaerhodopsin-3 from Halorubrum sodomense (Arch), a light-driven outward proton pump, when genetically expressed in neurons, enables them to be powerfully, transiently, and repeatedly silenced in response to pulses of light. Because of the impressive characteristics of Arch, we explored the optogenetic utility of opsins with high sequence homology to Arch, from archaea of the Halorubrum genus. We found that the archaerhodopsin from Halorubrum strain TP009, which we named ArchT, could mediate photocurrents of similar maximum amplitude to those of Arch (∼900 pA in vitro), but with a >3-fold improvement in light sensitivity over Arch, most notably in the optogenetic range of 1-10 mW/mm(2), equating to >2× increase in brain tissue volume addressed by a typical single optical fiber. Upon expression in mouse or rhesus macaque cortical neurons, ArchT expressed well on neuronal membranes, including excellent trafficking for long distances down neuronal axons. The high light sensitivity prompted us to explore ArchT use in the cortex of the rhesus macaque. Optical perturbation of ArchT-expressing neurons in the brain of an awake rhesus macaque resulted in a rapid and complete (∼100%) silencing of most recorded cells, with suppressed cells achieving a median firing rate of 0 spikes/s upon illumination. A small population of neurons showed increased firing rates at long latencies following the onset of light stimulation, suggesting the existence of a mechanism of network-level neural activity balancing. The powerful net suppression of activity suggests that ArchT silencing technology might be of great use not only in the causal analysis of neural circuits, but may have therapeutic applications.

ABSTRACT Optogenetic neuronal network manipulation promises to at last unravel a long-standing mystery in neuroscience: how does microcircuit activity causally relate to behavioral and pathological states? The challenge to evoke spikes with high spatial and temporal complexity necessitates further joint development of light-delivery approaches and custom opsins. Two-photon scanning and parallel illumination strategies applied to ChR2- and C1V1-expressing neurons demonstrated reliable, in-depth generation of action potentials both in-vitro and in-vivo , but thus far lack the temporal precision necessary to induce precisely timed spiking events. Here, we show that efficient current integration enabled by two-photon holographic amplified laser illumination of Chronos, a highly light-sensitive and fast opsin, can evoke spikes with submillisecond precision and repeated firing up to 100 Hz. These results pave the way for optogenetic manipulation with the spatial and temporal sophistication necessary to mimic natural microcircuit activity.

Animals are often bombarded with visual information and must prioritize specific visual features based on their current needs. The neuronal circuits that detect and relay visual features have been well-studied. Yet, much less is known about how an animal adjusts its visual attention as its goals or environmental conditions change. During social behaviors, flies need to focus on nearby flies. Here, we study how the flow of visual information is altered when female Drosophila enter an aggressive state. From the connectome, we identified three state-dependent circuit motifs poised to selectively amplify the response of an aggressive female to fly-sized visual objects: convergence of excitatory inputs from neurons conveying select visual features and internal state; dendritic disinhibition of select visual feature detectors; and a switch that toggles between two visual feature detectors. Using cell-type-specific genetic tools, together with behavioral and neurophysiological analyses, we show that each of these circuit motifs function during female aggression. We reveal that features of this same switch operate in males during courtship pursuit, suggesting that disparate social behaviors may share circuit mechanisms. Our work provides a compelling example of using the connectome to infer circuit mechanisms that underlie dynamic processing of sensory signals.

Vision provides animals with detailed information about their surroundings, conveying diverse features such as color, form, and movement across the visual scene. Computing these parallel spatial features requires a large and diverse network of neurons, such that in animals as distant as flies and humans, visual regions comprise half the brain's volume. These visual brain regions often reveal remarkable structure-function relationships, with neurons organized along spatial maps with shapes that directly relate to their roles in visual processing. To unravel the stunning diversity of a complex visual system, a careful mapping of the neural architecture matched to tools for targeted exploration of that circuitry is essential. Here, we report a new connectome of the right optic lobe from a male Drosophila central nervous system FIB-SEM volume and a comprehensive inventory of the fly's visual neurons. We developed a computational framework to quantify the anatomy of visual neurons, establishing a basis for interpreting how their shapes relate to spatial vision. By integrating this analysis with connectivity information, neurotransmitter identity, and expert curation, we classified the ~53,000 neurons into 727 types, about half of which are systematically described and named for the first time. Finally, we share an extensive collection of split-GAL4 lines matched to our neuron type catalog. Together, this comprehensive set of tools and data unlock new possibilities for systematic investigations of vision in Drosophila, a foundation for a deeper understanding of sensory processing.