Pro-inflammatory immune responses are necessary for effective pathogen clearance, but cause severe tissue damage if not shut down in a timely manner 1,2 . Excessive complement and IFN-γ-associated responses are known drivers of immunopathogenesis 3 and are among the most highly induced immune programs in hyper-inflammatory SARS-CoV2 lung infection 4 . The molecular mechanisms that govern orderly shutdown and retraction of these responses remain poorly understood. Here, we show that complement triggers contraction of IFN-γ producing CD4 + T helper (Th) 1 cell responses by inducing expression of the vitamin D (VitD) receptor (VDR) and CYP27B1, the enzyme that activates VitD, permitting T cells to both activate and respond to VitD. VitD then initiates the transition from pro-inflammatory IFN-γ + Th1 cells to suppressive IL-10 + Th1 cells. This process is primed by dynamic changes in the epigenetic landscape of CD4 + T cells, generating superenhancers and recruiting c-JUN and BACH2, a key immunoregulatory transcription factor 5–7 . Accordingly, cells in psoriatic skin treated with VitD increased BACH2 expression, and BACH2 haplo-insufficient CD4 + T cells were defective in IL-10 production. As proof-of-concept, we show that CD4 + T cells in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of patients with COVID-19 are Th1-skewed and that VDR is among the top regulators of genes induced by SARS-CoV2. Importantly, genes normally down-regulated by VitD were de-repressed in CD4 + BALF T cells of COVID-19, indicating that the VitD-driven shutdown program is impaired in this setting. The active metabolite of VitD, alfacalcidol, and cortico-steroids were among the top predicted pharmaceuticals that could normalize SARS-CoV2 induced genes. These data indicate that adjunct therapy with VitD in the context of other immunomodulatory drugs may be a beneficial strategy to dampen hyperinflammation in severe COVID-19.

Complement activation may facilitate hypertension through its effects on immune responses. The anaphylatoxin C5a, a major inflammatory effector, binds to the C5a receptor 1 and 2 (C5aR1, C5aR2). We have recently shown that C5aR1-/- mice have reduced hypertensive renal injury. The role of C5aR2 in hypertension is unknown.

Cytokine-induced signaling pathways are tightly regulated and self-limiting, as their dysregulation causes immune disorders and cancer. The precise mechanisms that fine-tune these responses are incompletely understood. We show that the E3 ubiquitin ligase RNF144A is an IL-2/STAT5-induced gene in T cells and critically orchestrates the hierarchy of IL-2R signaling to promote STAT5 activation and limit RAF-ERK-MAPK output from the IL-2R. Mechanistically, RNF144A increased the interaction between IL-2Rβ and STAT5 and polyubiquitinated RAF1, enhancing its proteasomal degradation and preventing the formation of the potent RAF1/BRAF kinase complex. CD8+ T cells from Rnf144a-/- mice had impaired IL-2-induction of effector genes, including Tnf and granzymes, and these mice demonstrated increased susceptibility to influenza. Reduced RNF144A expression was associated with more severe influenza in humans and its expression in patients was a biomarker distinguishing moderate from severe disease. These studies reveal a vital physiological role for RNF144A in maintaining the fidelity of IL-2R signaling in CTLs to prevent severe inflammation in response to infection.

Summary Next generation sequencing technologies have revolutionized the study of T cell biology, capturing previously unrecognized diversity in cellular states and functions. Pathway analysis is a key analytical stage in the interpretation of such transcriptomic data, providing a powerful method for detecting alterations in important biological processes. Current pathway analysis tools are built on models developed for bulk-RNA sequencing, limiting their effectiveness when applied to more complex single cell RNA-sequencing (scRNA-seq) datasets. We recently developed a sensitive and distribution-free statistical framework for multisample distribution testing, which we implement here in the open-source R package Single Cell Pathway Analysis (SCPA). After demonstrating the effectiveness of SCPA over commonly used methods, we generate a scRNA-seq T cell dataset and characterize pathway activity over early cellular activation and between T cell populations. This revealed unexpected regulatory pathways in T cells, such as an intrinsic type I interferon system regulating T cell survival and a reliance on arachidonic acid metabolism throughout T cell activation. A systems level characterization of pathway activity in T cells across multiple human tissues also revealed alpha defensin expression as a hallmark of bone marrow derived T cells. Overall, our work here provides a widely applicable tool for single cell pathway analysis, and highlights unexpected regulatory mechanisms of T cells using a novel T cell dataset.