Colistin is a last-resort antibiotic that is used to treat severe infections caused by MDR and extensively drug-resistant (XDR) bacteria. The World Health Organization (WHO) has designated colistin as a “highest priority critically important antimicrobial for human medicine” (WHO, Critically Important Antimicrobials for Human Medicine , 5th revision , 2017, https://www.who.int/foodsafety/publications/antimicrobials-fifth/en/ ), as it is often one of the only therapies available for treating serious bacterial infections in critically ill patients. Plasmid-borne mcr genes that confer resistance to colistin pose a threat to public health at an international scale, as they can be transmitted via horizontal gene transfer and have the potential to spread globally. Therefore, the establishment of a complete reference of mcr genes that can be used to screen for plasmid-mediated colistin resistance is essential for developing effective control strategies.

Biosynthetic gene clusters (BGCs) are enticing targets for (meta)genomic mining efforts, as they may encode novel, specialized metabolites with potential uses in medicine and biotechnology. Here, we describe GECCO (GEne Cluster prediction with COnditional random fields; https://gecco.embl.de ), a high-precision, scalable method for identifying novel BGCs in (meta)genomic data using conditional random fields (CRFs). Based on an extensive evaluation of de novo BGC prediction, we found GECCO to be more accurate and over 3x faster than a state-of-the-art deep learning approach. When applied to over 12,000 genomes, GECCO identified nearly twice as many BGCs compared to a rule-based approach, while achieving higher accuracy than other machine learning approaches. Introspection of the GECCO CRF revealed that its predictions rely on protein domains with both known and novel associations to secondary metabolism. The method developed here represents a scalable, interpretable machine learning approach, which can identify BGCs de novo with high precision.

Summary Microbes are phylogenetically and metabolically diverse. Yet capturing this diversity, assigning functions to host organisms and exploring the biosynthetic potential in natural environments remains challenging. We reconstructed >25,000 draft genomes, including from >2,500 uncharacterized species, from globally-distributed ocean microbial communities, and combined them with ∼10,000 genomes from cultivated and single cells. Mining this resource revealed ∼40,000 putative biosynthetic gene clusters (BGCs), many from unknown phylogenetic groups. Among these, we discovered Candidatus Eudoremicrobiaceae as one of the most biosynthetically diverse microbes detected to date. Discrete transcriptional states structuring natural populations were associated with a potentially niche-partitioning role for BGC products. Together with the characterization of the first Eudoremicrobiaceae natural product, this study demonstrates how microbiomics enables prospecting for candidate bioactive compounds in underexplored microbes and environments.

Abstract Bacillus cereus group or B. cereus sensu lato (s.l.), is comprised of Gram-positive spore-forming, rod-like bacteria that are widespread in natural environments. Although the species in this group are known to be highly related in terms of phenotypic characteristics, they display different levels of pathogenicity. Biochemical assays are therefore considered to be insufficient for accurate taxonomic classification of B. cereus group species. To facilitate accurate taxonomic classification and associated prediction of pathogenic potential, we have conducted comparative genomic analyses of publicly available genome assemblies of B. cereus group isolates. Through that, we found that an isolate previously known as B. mycoides ATCC 21929 was sufficiently distant from valid and effective type strains to be considered a putative new species. We have conducted biochemical and bioinformatic characterization of strain ATCC 21929 that had been isolated from soil in Papua New Guinea. Strain ATCC 21929 most closely resembles B. paramycoides NH24A2 T , producing ANIb and DDH values of 86.70% and 34.1%, respectively. Phenotypically, isolate ATCC 21929 does not possess cytochrome c oxidase activity, and is able to grow at a range of temperatures 15°C - 43°C and at a range of pH 6 - 9. With regards to fatty acid composition, this isolate has iso-C17:0 in highest abundance. We propose the strain ATCC 21929 T (=PS00077A T = PS00077B T = PSU-0922 T = BHP T ) as a new species named Bacillus clarus sp. nov. to facilitate accurate taxonomic classification of B. cereus group isolates.

Abstract Mobilized colistin resistance genes ( mcr ) may confer resistance to colistin, a last-resort, critically important antimicrobial for human health. mcr can often be transmitted horizontally (e.g., via mobile genetic elements); however, mcr encode phosphoethanolamine transferases (PET) closely related to chromosomally encoded, intrinsic lipid modification enzymes (e.g., EptA, EptB, CptA). To explore the genetic diversity of mcr within the context of intrinsic lipid modification PET, we identified 9,836 non-redundant protein accession numbers associated with mcr -like genes, representing a total of 69,814 mcr -like genes present across 256 bacterial genera. We subsequently identified 125 unique, putative novel mcr -like genes encoded on the same contig as a plasmid replicon and other antimicrobial resistance genes. Sequence similarity and a maximum likelihood phylogeny of mcr , putative novel mcr -like genes, and intrinsic lipid modification PET-encoding genes indicated that sequence similarity is insufficient to discriminate between genes involved in colistin resistance and genes encoding intrinsic lipid modification PET. A mixed-effect model of evolution (MEME) indicated that site- and branch-specific diversifying positive selection might have played a role in the evolution of subvariants within the mcr-2 and mcr-9 families. MEME suggested that positive selection played a role in the diversification of several residues in structurally important regions, including (i) a bridging region that connects the membrane-bound and catalytic periplasmic domains, and (ii) a periplasmic loop juxtaposing the substrate entry tunnel. These residues were found to be differentially conserved in different mcr families and thus may play a role in mcr subvariant phenotypic diversity. Moreover, we found that eptA and mcr are localized within different genomic contexts. Canonical eptA are typically chromosomally encoded in an operon with a two-component regulatory system or adjacent to a TetR-type regulator. In contrast, mcr are encoded as single-gene operons or adjacent to pap2 and dgkA , which encode a PAP2 family lipid A phosphatase and diacylglycerol kinase, respectively. Our data suggest that eptA can give rise to “colistin resistance genes” through various mechanisms, including selection and diversification of the genomic context, regulatory pathways, and mobilization. These mechanisms likely altered gene expression levels and enzyme activity, allowing bona fide eptA to evolve to function in colistin resistance.

Abstract Cereulide-producing members of Bacillus cereus sensu lato ( B. cereus s.l. ) Group III, also known as “emetic B. cereus ”, possess cereulide synthetase, a plasmid-encoded, non-ribosomal peptide synthetase encoded by the ces gene cluster. Despite the documented risks that cereulide-producing strains pose to public health, the level of genomic diversity encompassed by “emetic B. cereus ” has never been evaluated at a whole-genome scale. Here, we employ a phylogenomic approach to characterize Group III B. cereus s.l. genomes which possess ces ( ces -positive) alongside their closely related ces -negative counterparts to (i) assess the genomic diversity encompassed by “emetic B. cereus ”, and (ii) identify potential ces loss and/or gain events within the evolutionary history of the high-risk and medically relevant sequence type (ST) 26 lineage often associated with emetic foodborne illness. Using all publicly available ces -positive Group III B. cereus s.l. genomes and the ces -negative genomes interspersed among them ( n = 150), we show that “emetic B. cereus ” is not clonal; rather, multiple lineages within Group III harbor cereulide-producing strains, all of which share a common ancestor incapable of producing cereulide (posterior probability [PP] 0.86-0.89). The ST 26 common ancestor was predicted to have emerged as ces -negative (PP 0.60-0.93) circa 1904 (95% highest posterior density [HPD] interval 1837.1-1957.8) and first acquired the ability to produce cereulide before 1931 (95% HPD 1893.2-1959.0). Three subsequent ces loss events within ST 26 were observed, including among isolates responsible for B. cereus s.l. toxicoinfection (i.e., “diarrheal” illness). Importance “ B. cereus ” is responsible for thousands of cases of foodborne disease each year worldwide, causing two distinct forms of illness: (i) intoxication via cereulide (i.e., “emetic” syndrome) or (ii) toxicoinfection via multiple enterotoxins (i.e., “diarrheal” syndrome). Here, we show that “emetic B. cereus ” is not a clonal, homogenous unit that resulted from a single cereulide synthetase gain event followed by subsequent proliferation; rather, cereulide synthetase acquisition and loss is a dynamic, ongoing process that occurs across lineages, allowing some Group III B. cereus s.l. populations to oscillate between diarrheal and emetic foodborne pathogen over the course of their evolutionary histories. We also highlight the care that must be taken when selecting a reference genome for whole-genome sequencing-based investigation of emetic B. cereus s.l. outbreaks, as some reference genome selections can lead to a confounding loss of resolution and potentially hinder epidemiological investigations.

Abstract The Bacillus cereus group, also known as B. cereus sensu lato ( s.l. ), is a species complex comprising numerous closely related lineages, which vary in their ability to cause illness in humans and animals. The classification of B. cereus s.l. isolates into species-level taxonomic units is essential for facilitating communication between and among microbiologists, clinicians, public health officials, and industry professionals, but is not always straightforward. A recently proposed genomospecies-subspecies-biovar taxonomic framework aims to provide a standardized nomenclature for this species complex but relies heavily on whole-genome sequencing (WGS), a technology with limited accessibility. It thus is unclear whether popular, low-cost typing methods (e.g., single- and multi-locus sequence typing) remain congruent with the proposed taxonomy. Here, we characterize 2,231 B. cereus s.l. genomes using a combination of in silico (i) average-nucleotide identity (ANI)-based genomospecies assignment, (ii) ANI-based subspecies assignment, (iii) seven-gene multi-locus sequence typing (MLST), (iv) panC group assignment, (v) rpoB allelic typing, and (vi) virulence factor detection. We show that sequence types (STs) assigned using MLST can be used for genomospecies assignment, and we provide a comprehensive list of ST/genomospecies associations. For panC group assignment, we show that an adjusted, eight-group framework is largely congruent with the proposed eight-genomospecies taxonomy and resolves incongruencies observed in the historical seven-group framework among isolates assigned to panC Groups II, III, and VI. We additionally provide a list of loci that capture the topology of the whole-genome B. cereus s.l. phylogeny that may be used in future sequence typing efforts. For researchers with access to WGS, MLST, and/or panC data, we showcase how our recently released software, BTyper3 ( https://github.com/lmc297/BTyper3 ), can be used to assign B. cereus s.l. isolates to taxonomic units within this proposed framework with little-to-no user intervention or domain-specific knowledge of B. cereus s.l. taxonomy. We additionally outline a novel method for assigning B. cereus s.l. genomes to pseudo-gene flow units within proposed genomospecies. The results presented here highlight the backwards-compatibility and accessibility of the proposed taxonomic framework and illustrate that WGS is not a necessity for microbiologists who want to use the proposed taxonomy effectively.

Abstract The gut microbiota influences human health and the development of chronic diseases. However, our understanding of potentially protective or harmful microbe-host interactions at the molecular level is still in its infancy. To gain further insights into the hidden gut metabolome and its impact, we identified a cryptic non-ribosomal peptide BGC in the genome of Bacillus cereus DSM 28590 from the mouse intestine ( www.dsmz.de/miBC ), which was predicted to encode a thiazol(in)e substructure. Cloning and heterologous expression of this BGC revealed that it produces bacillamide D. In-depth functional evaluation showed potent cytotoxicity and inhibition of cell migration using the human cell lines HCT116 and HEK293, which was validated using primary mouse organoids. This work establishes the bacillamides as selective cytotoxins from a bacterial gut isolate that affect mammalian cells. Our targeted structure-function-predictive approach is demonstrated to be a streamlined method to discover deleterious gut microbial metabolites with potential effects on human health.

Abstract It is now easy to perform multiome single-cell analysis, including both RNA and ATAC readouts from the same cell. This enables a closer linkage between the two types of modalities, but it remains an open question what more information can be extracted from this type of data. ATAC-seq is normally only used to assay transcription factor binding to open regions. By reanalyzing several large datasets, and generating an atlas of B cells, we show that telomere accessibility can better pinpoint processes related to cell cycle and chromatin condensation. We provide Telomemore, a tool that can extract telomeric reads, and give examples of new findings it enables. Our new findings will aid in the annotation and analysis of single-cell ATAC or multiome datasets.

Abstract Macrococcus species have been isolated from a range of mammals and mammal-derived food products. While they are largely considered to be animal commensals, Macrococcus spp. can be opportunistic pathogens in both veterinary and human clinical settings. This study aimed to provide insight into the evolution, population structure, and functional potential of the Macrococcus genus, with an emphasis on antimicrobial resistance (AMR) and virulence potential. All high-quality, publicly available Macrococcus genomes ( n = 104, accessed 27 August 2022), plus six South African genomes sequenced here (two strains from bovine clinical mastitis cases and four strains from beef products), underwent taxonomic assignment (using four different approaches), AMR determinant detection (via AMRFinderPlus), and virulence factor detection (using DIAMOND and the core Virulence Factor Database). Overall, the 110 Macrococcus genomes were of animal commensal, veterinary clinical, food-associated (including food spoilage), and environmental origins; five genomes (4.5%) originated from human clinical cases. Notably, none of the taxonomic assignment methods produced identical results, highlighting the potential for Macrococcus species misidentifications. The most common predicted antimicrobial classes associated with AMR determinants identified across Macrococcus included macrolides, beta-lactams, and aminoglycosides ( n = 81, 61, and 44 of 110 genomes; 73.6, 55.5, and 40.0%, respectively). Genes showing homology to Staphylococcus aureus exoenzyme aureolysin were detected across multiple species (using 90% coverage, n = 40 and 77 genomes harboring aureolysin-like genes at 60% and 40% amino acid [AA] identity, respectively). Staphylococcus aureus Panton-Valentine leucocidin toxin-associated lukF-PV and lukS-PV homologs were identified in eight M. canis genomes (≥40% AA identity, >85% coverage). Using a method that delineates populations using recent gene flow (PopCOGenT), two species ( M. caseolyticus and M. armenti ) were composed of multiple within-species populations. Notably, M. armenti was partitioned into two populations, which differed in functional potential (e.g., one harbored beta-lactamase family, type II toxin-antitoxin system, and stress response proteins, while the other possessed a Type VII secretion system; PopCOGenT P < 0.05). Overall, this study leverages all publicly available Macrococcus genomes in addition to newly sequenced genomes from South Africa to identify genomic elements associated with AMR or virulence potential, which can be queried in future experiments.