Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) catalyze the oxidative cleavage of polysaccharides. Identification of a hydrogen peroxide–dependent pathway for sugar oxidation by these enzymes challenges the prevailing model that LPMOs are oxygen-dependent monooxygenases. Enzymes currently known as lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) play an important role in the conversion of recalcitrant polysaccharides, but their mode of action has remained largely enigmatic. It is generally believed that catalysis by LPMOs requires molecular oxygen and a reductant that delivers two electrons per catalytic cycle. Using enzyme assays, mass spectrometry and experiments with labeled oxygen atoms, we show here that H2O2, rather than O2, is the preferred co-substrate of LPMOs. By controlling H2O2 supply, stable reaction kinetics are achieved, the LPMOs work in the absence of O2, and the reductant is consumed in priming rather than in stoichiometric amounts. The use of H2O2 by a monocopper enzyme that is otherwise cofactor-free offers new perspectives regarding the mode of action of copper enzymes. Furthermore, these findings have implications for the enzymatic conversion of biomass in Nature and in industrial biorefining.

ABSTRACT β-Mannans are hemicelluloses that are abundant in modern diets as components in seed endosperms and common additives in processed food. Currently, the collective understanding of β-mannan saccharification in the human colon is limited to a few keystone species, which presumably liberate low-molecular-weight mannooligosaccharide fragments that become directly available to the surrounding microbial community. Here we show that a dominant butyrate-producer in the human gut, Faecalibacterium prausnitzii , is able to acquire and degrade various β-mannooligosaccharides (β-MOS), which are derived by the primary mannanolytic activity of neighboring gut microbiota. Detailed biochemical analyses of selected protein components from their two β-mannooligosaccharides (β-MOS) utilization loci ( Fp MULs) supported a concerted model whereby the imported β-MOS are stepwise disassembled intracellularly by highly adapted enzymes. Coculturing experiments of F. prausnitzii with the primary degrader Bacteroides ovatus on polymeric β-mannan resulted in syntrophic growth and production of butyrate, thus confirming the high efficiency of the Fp MULs’ uptake system. Genomic comparison with human F. prausnitzii strains and analyses of 2441 public human metagenomes revealed that Fp MULs are highly conserved and distributed worldwide. Together, our results provide a significant advance in the knowledge of β-mannans metabolism and the degree to which its degradation is mediated by cross-feeding interactions between prominent beneficial microbes in the human gut. Importance Commensal butyrate-producing bacteria belonging to the Firmicutes phylum are abundant in the human gut and are crucial for maintaining health. Currently, insight is lacking into how they target otherwise indigestible dietary fibers and into the trophic interactions they establish with other glycan degraders in the competitive gut environment. By combining cultivation, genomic and detailed biochemical analyses this work reveals the mechanism enabling F. prausnitzii , as a model clostridial cluster IV Firmicute, to cross-feed and access β-mannan-derived oligosaccharides released in the gut ecosystem by the action of primary degraders. A comprehensive survey of human gut metagenomes shows that Fp MULs are ubiquitous in human populations globally, highlighting the importance of microbial metabolism of β-mannans/β-MOS as a common dietary component. Our findings provide a mechanistic understanding of the β-MOS utilization capability by F. prausnitzii that may be exploited to select dietary formulations specifically boosting this beneficial symbiont, thus butyrate production, in the gut.

The discovery of Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) has been instrumental for the development of economically sustainable lignocellulose biorefineries. Despite the obvious importance of these exceptionally powerful redox enzymes, their mode of action remains enigmatic and their activity and stability under process conditions are hard to control. By using enzyme assays, mass spectrometry and experiments with labeled oxygen atoms, we show that H2O2, and not O2 as previously thought, is the co-substrate of LPMOs. By controlling H2O2 supply, stable reaction kinetics and high enzymatic rates are achieved, the LPMOs work under anaerobic conditions, and the need for adding stoichiometric amounts of reductants is alleviated. These results offer completely new perspectives regarding the mode of action of these unique mono-copper enzymes, the enzymatic conversion of biomass in Nature, and industrial biorefining.

Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) are a recently discovered class of monocopper enzymes, broadly distributed across the Tree of Life. We recently reported that LPMOs can use H2O2 as an oxidant, revealing a novel reaction pathway. Here, we aimed to elucidate the H2O2-mediated reaction mechanism with experimental and computational approaches. In silico studies suggest that a network of hydrogen bonds, involving both the enzyme and the substrate, brings H2O2 into a strained reactive conformation, and guides the derived hydroxyl radical towards formation of a copper-oxyl intermediate. The initial H2O2 homolytic cleavage and subsequent hydrogen atom abstraction from chitin by the copper-oxyl intermediate are suggested to be the main energy barriers. Under single turnover conditions, stopped-flow fluorimetry demonstrates that LPMO-Cu(II) reduction to Cu(I) is a fast process compared to the re-oxidation reactions. We found that re-oxidation of LPMO-Cu(I) is 2000-fold faster with H2O2 than with O2, the latter being several orders of magnitude slower than rates reported for other monooxygenases. In agreement with the notion of ternary complex formation, when chitin is added, re-oxidation by H2O2 is accelerated whereas that by O2 slows. Simulations indicated that Glu60, a highly-conserved residue, gates the access to the confined active site and constrains H2O2 during catalysis, and Glu60 mutations significantly decreased the enzyme performance. By providing molecular and kinetic insights into the peroxygenase activity of chitinolytic LPMOs, this study will aid the development of applications of enzymatic and synthetic copper catalysis and contribute to understanding pathogenesis, notably chitinolytic plant defenses against fungi and insects.

β-Mannans and xylans are important components of the plant cell wall and they are acetylated to be protected from degradation by glycoside hydrolases. β-Mannans are widely present in human and animal diets as fiber from leguminous plants and as thickeners and stabilizers in processed foods. There are many fully characterized acetylxylan esterases (AcXEs), however, the enzymes deacetylating mannans are less understood. Here we present two carbohydrate esterases, RiCE2 and RiCEX, from the Firmicute Roseburia intestinalis, which together deacetylate complex galactoglucomannan (GGM). The 3D-structure of RiCEX with a mannopentaose in the active site shows that the CBM35 domain of RiCEX forms a confined complex, where the axially oriented C2-hydroxyl of a mannose residue points towards the Ser41 of the catalytic triad. Cavities on the RiCEX surface may accept galactosylations at the C6 positions of mannose adjacent to the mannose residue being deacetylated (subsite -1 and +1). In depth characterization of the two enzymes using time-resolved NMR, HPLC and mass spectrometry demonstrates that they work in a complementary manner. RiCEX exclusively removes the axially oriented 2-O-acetylations on any mannose residue in an oligosaccharide, including double acetylated mannoses, while the RiCE2 is active on 3-O-, 4-O- and 6-O-acetylations. Activity of RiCE2 is dependent on RiCEX removing 2-O-acetylations from double acetylated mannose. Furthermore, transacetylation of oligosaccharides with the 2-O specific RiCEX provided new insight to how temperature and pH affects acetyl migration on mannooligosaccharides.