Extracellular vesicles (EVs) have been established to play important roles in cell-cell communication and shown promise as therapeutic agents. However, we still lack a basic understanding of how cells respond upon exposure to EVs from different cell sources at various doses. Thus, we treated fibroblasts with EVs from 12 different cell sources at doses between 20 and 200,000 per cell, analyzed their transcriptional effects, and functionally confirmed the findings in various cell types in vitro, and in vivo using single-cell RNA sequencing. Unbiased global analysis revealed EV dose to have a more significant effect than cell source, such that high doses down-regulated exocytosis and up-regulated lysosomal activity. However, EV cell source-specific responses were observed at low doses, and these reflected the activities of the EV's source cells. Last, we assessed EV-derived transcript abundance and found that immune cell-derived EVs were most associated with recipient cells. Together, this study provides important insights into the cellular response to EVs.

Abstract Fracture non-union occurs as a consequence of various factors, leading to the development of potentially substantial bone defects. Biomaterial-based approaches for bone regeneration aim to explore alternative strategies to repair non-healing fractures and critical-sized bone defects. Thus, rigorous assessment of the ability to translate biomaterials towards clinical use is vital. Growth factors induce an effect on cells to change their phenotype, behaviour and initiate signalling pathways, leading to an effect on matrix deposition and tissue formation. Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) is a potent osteogenic growth factor, with a rapid clearance time in vivo necessitating clinical use of high doses, with potential deleterious side-effects. This work explored the potential for Laponite™ nanoclay coating of poly(caprolactone) trimethacrylate (PCL-TMA900) scaffolds to bind BMP-2 for enhanced osteoinduction. In vitro experiments confirmed the cytocompatibility of the PCL-TMA900 scaffolds and effective osteogenic differentiation of C2C12 myoblast cells in response to the Laponite/BMP-2 coating. The chorioallantoic membrane (CAM) assay verified PCL-TMA900 scaffold material biocompatibility and ability to support angiogenesis. A murine subcutaneous implantation model assessed heterotopic bone formation in response to the Laponite/BMP-2 coating, when used immediately post-coating and after 24 hours of room temperature storage, to evaluate a delayed use manner. The Laponite/BMP-2 coated PCL-TMA900 scaffolds implanted showed consistent, significant bone formation over the study period compared to the uncoated PCL-TMA 900 scaffold and BMP-2 only coated control scaffolds in vivo , indicating the ability of Laponite to bind the BMP-2 to the PCL-TMA900 scaffold. Bone formed peripherally around the Laponite/BMP-2 coated scaffold, with no aberrant bone formation observed. The Laponite/BMP-2 coating was found to retain its bioactivity after storage for 24 hours prior to use in vivo , however this was not to the same volume or reliability of bone formation as when used immediately post-coating. To take these studies forward, the Laponite/BMP-2 coating warrants examination in a critical-sized bone defect model to assess efficacy in an osseous site.

Abstract Bone tissue engineering is a rapidly advancing field that seeks to develop efficacious approaches for treating non-healing fractures and large bone defects. Healing complications arise due to trauma, disease, infection, aseptic loosening of orthopaedic implants or iatrogenic causes. An ideal biodegradable scaffold would induce and support bone formation until the bone matrix is sufficiently stable to facilitate healing. The current study has examined bone augmentation, using functionalised coated scaffolds, with the hypothesised potential to induce skeletal cell differentiation for the repair of critical-sized bone defects. However, challenges in clinical translation arise from the alterations in cellular microenvironment that are present in the translation from in vitro to in vivo with the application of animal models of progressively increasing size and complexity of the implantation site. 3D printed, porous poly(caprolactone) trimethacrylate (denoted PCL-TMA900) scaffolds were applied within a murine femur defect, stabilised by a polyimide intramedullary pin, to assess the efficacy of select coatings in inducing bone formation. The PCL-TMA900 scaffolds were coated with i) elastin-like polypeptide (ELP), ii) poly(ethyl acrylate)/fibronectin/bone morphogenetic protein-2 (PEA/FN/BMP-2), iii) both ELP and PEA/FN/BMP-2 concurrently, or iv) Laponite™ nanoclay binding BMP-2, as bioactive coatings. The murine femur defect model was refined to assess the coated PCL-TMA900 scaffolds in an osseous defect, with sequential microcomputed tomography (µCT) and histological analysis of the new bone tissue. Overall, PCL-TMA900 was found to be an optimal robust, biocompatible, 3D printable scaffold material. All PCL-TMA900 scaffolds, uncoated and coated, showed integration with the femur. The PCL-TMA900 scaffold coated with the nanoclay material Laponite™ and BMP-2 induced consistent, significant bone formation compared to the uncoated PCL-TMA900 scaffold. Bone formation was observed within the pores of the Laponite/BMP-2 coated scaffold. Critically, no heterotopic bone formation was observed as the BMP-2 was retained around the scaffold and not released into the tissues, producing bone around the scaffold in the desired shape and volume, compared to bone formation observed with the positive control (collagen sponge/BMP-2 construct). In comparison, the ELP coated and PEA/FN/BMP-2 scaffolds did not demonstrate significant or consistent bone formation compared to uncoated PCL-TMA900 control scaffolds. In summary, nanoclay Laponite™/BMP-2 coated PCL-TMA900 scaffolds offer a biodegradable, osteogenic construct for bone augmentation with potential for development into a large scale polymer scaffold for translation to the clinic.

Abstract It is technically challenging to study the content and properties of nanoscale bioparticles in a high-throughput and single-molecule manner. We developed a high-throughput analysis method, called single particle profiler (SPP) that provides single-particle information on content and biophysical properties of thousands of particles. We applied SPP to measure the mRNA encapsulation efficiency of lipid nanoparticles, viral binding efficiency of different nanobodies and biophysical heterogeneity of liposomes, lipoproteins, exosomes and viruses.

Abstract Biomaterial-based approaches for bone regeneration seek to explore alternative strategies to repair non-healing fractures and critical-sized bone defects. Fracture non-union occurs due to a number of factors resulting in the formation of bone defects. Rigorous evaluation of the biomaterials in relevant models and assessment of their potential to translate towards clinical use is vital. Large animal experimentation can be used to model fracture non-union while scaling-up materials for clinical use. Growth factors modulate cell phenotype, behaviour and initiate signalling pathways leading to changes in matrix deposition and tissue formation. Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) is a potent osteogenic growth factor, with a rapid clearance time in vivo necessitating clinical use at a high dose, with potential deleterious side-effects. The current studies have examined the potential for Laponite ® nanoclay coated poly(caprolactone) trimethacrylate (PCL-TMA900) scaffolds to bind BMP-2 for enhanced osteoinduction in a large animal critical-sized bone defect. An ovine femoral condyle defect model confirmed PCL-TMA900 scaffolds coated with Laponite ® /BMP-2 produced significant bone formation compared to the uncoated PCL-TMA 900 scaffold in vivo , assessed by micro-computed tomography (µCT) and histology. This indicated the ability of Laponite ® to deliver the bioactive BMP-2 on the PCL-TMA900 scaffold. Bone formed around the Laponite ® /BMP-2 coated PCL-TMA900 scaffold, with no erroneous bone formation observed away from the scaffold material confirming localisation of BMP-2 delivery. The current studies demonstrate the ability of a nanoclay to localise and deliver bioactive BMP-2 within a tailored octet-truss scaffold for efficacious bone defect repair in a large animal model with significant implications for translation to the clinic.

Strand displacement reactions underlie dynamic nucleic acid nanotechnology. The kinetic and thermodynamic features of DNA-based displacement reactions are well understood and well predicted by current computational models. By contrast, understanding of RNA/DNA hybrid strand displacement kinetics is limited, restricting the design of increasingly complex RNA/DNA hybrid reaction networks with more tightly regulated dynamics. Given the importance of RNA as a diagnostic biomarker, and its critical role in intracellular processes, this shortfall is particularly limiting for the development of strand displacement-based therapeutics and diagnostics. Herein, we characterise 22 RNA/DNA hybrid strand displacement systems, systematically varying several common design parameters including toehold length and branch migration domain length. We observe the differences in stability between RNA-DNA hybrids and DNA-DNA duplexes have large effects on strand displacement rates, with rates for equivalent sequences differing by up to 3 orders of magnitude. Crucially, however, this effect is strongly sequence-dependent, with RNA invaders strongly favoured in a system with RNA strands of high purine content, and disfavoured in a system when the RNA strands have low purine content. These results lay the groundwork for more general design principles, allowing for creation of de novo reaction networks with novel complexity while maintaining predictable reaction kinetics.