LEOPARD syndrome (LS) is an autosomal dominant “RASopathy” that manifests with congenital heart disease. Nearly all cases of LS are caused by catalytically inactivating mutations in the protein tyrosine phosphatase (PTP), non-receptor type 11 (PTPN11) gene that encodes the SH2 domain-containing PTP-2 (SHP2). RASopathies typically affect components of the RAS/MAPK pathway, yet it remains unclear how PTPN11 mutations alter cellular signaling to produce LS phenotypes. We therefore generated knockin mice harboring the Ptpn11 mutation Y279C, one of the most common LS alleles. Ptpn11Y279C/+ (LS/+) mice recapitulated the human disorder, with short stature, craniofacial dysmorphia, and morphologic, histologic, echocardiographic, and molecular evidence of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). Heart and/or cardiomyocyte lysates from LS/+ mice showed enhanced binding of Shp2 to Irs1, decreased Shp2 catalytic activity, and abrogated agonist-evoked Erk/Mapk signaling. LS/+ mice also exhibited increased basal and agonist-induced Akt and mTor activity. The cardiac defects in LS/+ mice were completely reversed by treatment with rapamycin, an inhibitor of mTOR. Our results demonstrate that LS mutations have dominant-negative effects in vivo, identify enhanced mTOR activity as critical for causing LS-associated HCM, and suggest that TOR inhibitors be considered for treatment of HCM in LS patients.

Background For many patients with kidney failure, the cause and underlying defect remain unknown. Here, we describe a novel mechanism of a genetic order characterized by renal Fanconi syndrome and kidney failure. Methods We clinically and genetically characterized members of five families with autosomal dominant renal Fanconi syndrome and kidney failure. We performed genome-wide linkage analysis, sequencing, and expression studies in kidney biopsy specimens and renal cells along with knockout mouse studies and evaluations of mitochondrial morphology and function. Structural studies examined the effects of recognized mutations. Results The renal disease in these patients resulted from monoallelic mutations in the gene encoding glycine amidinotransferase (GATM), a renal proximal tubular enzyme in the creatine biosynthetic pathway that is otherwise associated with a recessive disorder of creatine deficiency. In silico analysis showed that the particular GATM mutations, identified in 28 members of the five families, create an additional interaction interface within the GATM protein and likely cause the linear aggregation of GATM observed in patient biopsy specimens and cultured proximal tubule cells. GATM aggregates-containing mitochondria were elongated and associated with increased ROS production, activation of the NLRP3 inflammasome, enhanced expression of the profibrotic cytokine IL-18, and increased cell death. Conclusions In this novel genetic disorder, fully penetrant heterozygous missense mutations in GATM trigger intramitochondrial fibrillary deposition of GATM and lead to elongated and abnormal mitochondria. We speculate that this renal proximal tubular mitochondrial pathology initiates a response from the inflammasome, with subsequent development of kidney fibrosis.

Abstract Mammalian genomes are subdivided into large (50-2000 kb) regions of chromatin referred to as Topologically Associating Domains (TADs or sub-TADs). Chromatin within an individual TAD contacts itself more frequently than with regions in surrounding TADs thereby directing enhancer-promoter interactions. In many cases, the borders of TADs are defined by convergently orientated boundary elements associated with CCCTC-binding factor (CTCF), which stabilises the cohesin complex on chromatin and prevents its translocation. This delimits chromatin loop extrusion which is thought to underlie the formation of TADs. However, not all CTCF-bound sites act as boundaries and, importantly, not all TADs are flanked by convergent CTCF sites. Here, we examined the CTCF binding sites within a ∼70 kb sub-TAD containing the duplicated mouse α-like globin genes and their five enhancers (5’-R1-R2-R3-Rm-R4-α1-α2-3’). The 5’ border of this sub-TAD is defined by a pair of CTCF sites. Surprisingly, we show that deletion of the CTCF binding sites within and downstream of the α-globin locus leaves the sub-TAD largely intact. The predominant 3’ border of the sub-TAD is defined by a steep reduction in contacts: this corresponds to the transcribed α2-globin gene rather than the CTCF sites at the 3’-end of the sub-TAD. Of interest, the almost identical α1- and α2-globin genes interact differently with the enhancers, resulting in preferential expression of the proximal α1-globin gene which behaves as a partial boundary between the enhancers and the distal α2-globin gene. Together, these observations provide direct evidence that actively transcribed genes can behave as boundary elements. Significance Statement Mammalian genomes are complex, organised 3D structures, partitioned into Topologically Associating Domains (TADs): chromatin regions that preferentially self-interact. These chromatin interactions are thought to be driven by a mechanism that continuously extrudes chromatin loops, forming structures delimited by chromatin boundary elements and reflecting the activity of enhancers and promoters. Boundary elements bind architectural proteins such as CCCTC-binding factor (CTCF). Previously, an overlap between the functional roles of enhancers and promoters has been shown. However, whether there is overlap between enhancers/promoters and boundary elements is not known. Here, we show that actively transcribed genes can also behave as boundary elements, similar to CTCF boundaries. In both cases, multi-protein complexes bound to these regions may stall the process of chromatin loop extrusion.

Significance Statement Renal tubular protein reabsorption has been of interest in the kidney community, and despite recognition of numerous associated inherited diseases, the detailed molecular basis remains poorly understood. We identified a missense mutation in EHD1 in six patients with tubular proteinuria and sensorineural hearing deficit, identifying the gene as a critical component of the renal protein reabsorption machinery and of inner ear function. EHD1, a key player in vesicular dynamics, has previously been associated with early ciliogenesis. However, no obvious defect of ciliogenesis was found in the kidneys of the patients nor in knockin and knockout mice. These data may contribute to a better understanding of the functional relevance of EHD1 in human tissues, particularly in the kidney and inner ear. Background The endocytic reabsorption of proteins in the proximal tubule requires a complex machinery and defects can lead to tubular proteinuria. The precise mechanisms of endocytosis and processing of receptors and cargo are incompletely understood. EHD1 belongs to a family of proteins presumably involved in the scission of intracellular vesicles and in ciliogenesis. However, the relevance of EHD1 in human tissues, in particular in the kidney, was unknown. Methods Genetic techniques were used in patients with tubular proteinuria and deafness to identify the disease-causing gene. Diagnostic and functional studies were performed in patients and disease models to investigate the pathophysiology. Results We identified six individuals (5–33 years) with proteinuria and a high-frequency hearing deficit associated with the homozygous missense variant c.1192C>T (p.R398W) in EHD1 . Proteinuria (0.7–2.1 g/d) consisted predominantly of low molecular weight proteins, reflecting impaired renal proximal tubular endocytosis of filtered proteins. Ehd1 knockout and Ehd1R398W/R398W knockin mice also showed a high-frequency hearing deficit and impaired receptor-mediated endocytosis in proximal tubules, and a zebrafish model showed impaired ability to reabsorb low molecular weight dextran. Interestingly, ciliogenesis appeared unaffected in patients and mouse models. In silico structural analysis predicted a destabilizing effect of the R398W variant and possible inference with nucleotide binding leading to impaired EHD1 oligomerization and membrane remodeling ability. Conclusions A homozygous missense variant of EHD1 causes a previously unrecognized autosomal recessive disorder characterized by sensorineural deafness and tubular proteinuria. Recessive EHD1 variants should be considered in individuals with hearing impairment, especially if tubular proteinuria is noted.

ABSTRACT While the elements encoding enhancers and promoters have been relatively well studied, the full spectrum of insulator elements which bind the CCCTC binding factor (CTCF), is relatively poorly characterised. This is partly due to the genomic context of CTCF sites greatly influencing their roles and activity. Here we have developed an experimental system to determine the ability of consistently sized, individual CTCF elements to interpose between enhancers and promoters and thereby reduce gene expression during differentiation. Importantly, each element is tested in the identical location thereby minimising the effect of genomic context. We found no correlation between the ability of CTCF elements to block enhancer-promoter activity with the amount of CTCF or cohesin bound at the natural genomic sites of these elements; the degree of evolutionary conservation; or their resemblance to the consensus core sequences. Nevertheless, we have shown that the strongest enhancer-promoter blockers include a previously described bound element lying upstream of the CTCF core motif. In addition, we found other uncharacterised DNaseI footprints located close to the core motif that may affect function. We have developed an assay of CTCF sequences which will enable researchers to sub-classify CTCF elements in a uniform and unbiased way.

53BP1 regulates DNA end-joining in lymphocytes, diversifying immune antigen receptors. This involves nucleosome-bound 53BP1 at DNA double-stranded breaks (DSBs) recruiting RIF1 and shieldin, a poorly understood DNA-binding complex. The 53BP1-RIF1-shieldin axis is pathological in

ABSTRACT Enhancers and their target promoters often come into close physical proximity when activated. This proximity may be explained by a variety of mechanisms; most recently via cohesin-mediated chromatin loop extrusion. Despite this compelling hypothesis, acute depletion of cohesin does not cause widespread changes in gene expression. We have tested the role of cohesin-mediated loop extrusion on gene expression at the mouse alpha-globin locus during erythropoiesis. Acute depletion of cohesin downregulates alpha-globin expression at early but not late stages of differentiation. When single or multiple CTCF sites are placed between the alpha-globin enhancers and promoters, alpha-gene expression is downregulated. Importantly, the orientation of the CTCF site plays a critical role, suggesting that within this activated domain, cohesin predominantly but not exclusively translocates from the enhancers to the promoters. We find that loop extrusion does play an important role in establishing enhancer-promoter proximity and consequent expression of inducible genes during differentiation.

In mice and humans, meiotic recombination begins with programmed DNA double-strand breaks at PRDM9-bound sites. These mainly resolve as difficult-to-detect non-crossovers, rather than crossovers. Here, we intercrossed two mouse subspecies over five generations and deep-sequenced 119 offspring, whose high heterozygosity allowed detection of 2,500 crossover and 1,575 non-crossover events with unprecedented power and spatial resolution. These events were strongly depleted at 'asymmetric' sites where PRDM9 mainly binds one homologue, implying they instead repair from the sister chromatid. This proves that symmetric PRDM9 binding promotes inter-homologue interactions, illuminating the mechanism of PRDM9-related hybrid infertility. Non-crossovers were surprisingly short (mean 30-41 bp), and complex non-crossovers, seen commonly in humans, were extremely rare. Unexpectedly, GC-biased gene conversion disappeared at non-crossovers containing multiple mismatches. These results demonstrate that local genetic diversity can alter meiotic repair pathway decisions in mammals by changing PRDM9 binding symmetry and non-crossover resolution, which influence genome evolution, fertility, and speciation.

A rare loss-of-function variant p.Arg138* in SLC30A8 encoding the zinc transporter 8 (ZnT8) enriched in Western Finland protects against type 2 diabetes (T2D). We recruited relatives of the identified carriers and showed that protection was associated with better insulin secretion due to enhanced glucose responsiveness and proinsulin conversion, especially compared with individuals matched for the genotype of a common T2D risk variant in SLC30A8, p.Arg325. In genome-edited human IPS-derived β-like cells, we establish that the p.Arg138* variant results in reduced SLC30A8 expression due to haploinsufficiency. In human β-cells loss of SLC30A8 leads to increased glucose responsiveness and reduced KATP channel function, which was also seen in isolated islets from carriers of the T2D-protective allele p.Trp325. These data position ZnT8 as an appealing target for treatment aiming at maintaining insulin secretion capacity in T2D.

Abstract For the preparation of embryo transfer recipients, surgically vasectomized mice are commonly used, generated by procedures associated with pain and discomfort. Sterile transgenic strains provide a nonsurgical replacement, but their maintenance requires breeding and genotyping procedures. We have previously reported the use of naturally sterile STUSB6F1 hybrids for the production of embryo transfer recipients and found the behavior of these recipients to be indistinguishable from those generated by vasectomized males. The method provides two substantial 3R impacts: refinement (when compared with surgical vasectomy) and reduction in breeding procedures (compared with sterile transgenic lines). Despite initial promise, the 3Rs impact of this innovation was limited by difficulties in breeding the parental STUS/Fore strain, which precluded the wider distribution of the sterile hybrid. The value of a 3R initiative is only as good as the uptake in the community. Here we, thus, select a different naturally sterile hybrid, generated from strains that are widely available: the B6SPRTF1 hybrid between C57BL/6J and Mus spretus . We first confirmed its sterility by sperm counting and testes weight and then trialed the recovery of cryopreserved embryos and germplasm within three UK facilities. Distribution of sperm for the generation of these hybrids by in vitro fertilization was found to be the most robust distribution method and avoided the need to maintain a live M. spretus colony. We then tested the suitability of B6SPRTF1 sterile hybrids for the generation of embryo transfer recipients at these same three UK facilities and found the hybrids to be suitable when compared with surgical vasectomized mice and a sterile transgenic strain. In conclusion, the potential 3Rs impact of this method was confirmed by the ease of distribution and the utility of sterile B6SPRTF1 hybrids at independent production facilities.