Abstract Whereas extracellular vesicle (EV) research has become commonplace in different biomedical fields, this field of research is still in its infancy in mycology. Here we provide a robust set of data regarding the structural and compositional aspects of EVs isolated from the fungal pathogenic species Cryptococcus neoformans, C. deneoformans and C. deuterogattii . Using cutting-edge methodological approaches including cryogenic electron microscopy and cryogenic electron tomography, proteomics, and flow cytometry, we revisited cryptococcal EV features and suggest a new EV structural model, in which the vesicular lipid bilayer is covered by mannoprotein-based fibrillar decoration, bearing the capsule polysaccharide as its outer layer. About 10% of the EV population is devoid of fibrillar decoration, adding another aspect to EV diversity. By analyzing EV protein cargo from the three species, we characterized the typical Cryptococcus EV proteome. It contains several membrane-bound protein families, including some Tsh proteins bearing a SUR7/PalI motif. The presence of known protective antigens on the surface of Cryptococcus EVs, resembling the morphology of encapsulated virus structures, suggested their potential as a vaccine. Indeed, mice immunized with EVs obtained from an acapsular C. neoformans mutant strain rendered a strong antibody response in mice and significantly prolonged their survival upon C. neoformans infection.

Abstract The protozoan parasite Leishmania donovani causes fatal human visceral leishmaniasis in absence of treatment. Genome instability has been recognized as a driver in Leishmania fitness gain in response to environmental change or chemotherapy. How genome instability generates beneficial phenotypes despite potential deleterious gene dosage effects is unknown. Here we address this important open question applying experimental evolution and integrative systems approaches on parasites adapting to in vitro culture. Phenotypic analyses of parasites from early and late stages of culture adaptation revealed an important fitness tradeoff, with selection for accelerated growth in promastigote culture (fitness gain) impairing infectivity (fitness costs). Comparative genomics, transcriptomics and proteomics analyses revealed a complex regulatory network driving parasite fitness, with genome instability causing highly reproducible, gene dosage-dependent changes in protein abundance linked to post-transcriptional regulation. These in turn were associated with a gene dosage-independent reduction in abundance of flagellar transcripts and a coordinated increase in abundance of coding and non-coding RNAs implicated in ribosomal biogenesis and protein translation. We correlated differential expression of small nucleolar RNAs (snoRNAs) with changes in rRNA modification, providing first evidence that Leishmania fitness gain in culture may be controlled by post-transcriptional and epitranscriptomic regulation. Our findings propose a novel model for Leishmania fitness gain in culture, where differential regulation of mRNA stability and the generation of fitness-adapted ribosomes may potentially filter deleterious from beneficial gene dosage effects and provide proteomic robustness to genetically heterogenous, adapting parasite populations. This model challenges the current, genome-centric approach to Leishmania epidemiology and identifies the Leishmania transcriptome and non-coding small RNome as potential novel sources for the discovery of biomarkers that may be associated with parasite phenotypic adaptation in clinical settings.

Summary Tunneling nanotubes (TNTs) are open actin- and membrane-based channels, connecting remote cells and allowing direct transfer of cellular material (e.g. vesicles, mRNAs, protein aggregates) from cytoplasm to cytoplasm. Although they are important especially in pathological conditions (e.g., cancers, neurodegenerative diseases), their precise composition and their regulation were still poorly described. Here, using a biochemical approach allowing to separate TNTs from cell bodies and from extracellular vesicles and particles (EVPs), we obtained the full composition of TNTs compared to EVPs. We then focused to two major components of our proteomic data, the CD9 and CD81 tetraspanins, and further investigated their specific roles in TNT formation and function. We show that these two tetraspanins have distinct non-redundant functions: CD9 participates in stabilizing TNTs, whereas CD81 expression is required to allow the functional transfer of vesicle in the newly formed TNTs, possibly by regulating docking to or fusion with the opposing cell.

Abstract Bacterial shape is physically determined by the peptidoglycan cell wall. The cell-wall-synthesis machinery responsible for rod shape in Escherichia coli is the processive ‘Rod complex’. Previously, cytoplasmic MreB filaments were thought to govern formation and localization of Rod complexes based on local cell-envelope curvature. However, using single-particle tracking of the transpeptidase PBP2, we found strong evidence that PBP2 initiates new Rod complexes by binding to a substrate different from MreB or any known Rod-complex component. This substrate is likely the cell wall. Consistently, we found only weak correlations between MreB and envelope curvature in the cylindrical part of cells. Residual correlations do not require any curvature-based Rod-complex initiation but can be attributed to persistent rotational motion. Therefore, local cell-wall architecture likely provides the cue for PBP2 binding and subsequent Rod-complex initiation. We also found that PBP2 has a limiting role for Rod-complex activity, thus supporting its central role.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) are outer membranous compartments produced by yeast and mycelial forms of several fungal species. One of the difficulties to perceive the role of EVs during the fungal life is the fact that an active secretion of these EVs has not been clearly demonstrated in situ due to the presence of a thick cell wall. One alternative to have a better access to these vesicles is to use protoplasts. This approach has been investigated here with Aspergillus fumigatus , one of the most common opportunistic fungal pathogens worldwide. Analysis of regenerating protoplasts by scanning electron microscopy and fluorescence microscopy indicated the occurrence of outer membrane projections in association with surface components and the release of particles with properties resembling those of fungal EVs. EVs in culture supernatants were characterized by transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analysis. Proteomic and glycome analysis of EVs revealed the presence of a complex array of enzymes related to lipid / sugar metabolism, pathogenic processes, and cell wall biosynthesis. Our data indicate that i) EV production is a common feature of different morphological stages of this major fungal pathogen, and ii) protoplastic EVs are a promising tool to undertake studies of vesicle functions in fungal cells. IMPORTANCE Fungal cells use extracellular vesicles (EVs) to export biologically active molecules to the outer space. Since fungal cells are encaged in a thick cell wall, it is reasonable to expect that this structure might impact the vesicle-mediated molecular export. In this study, we used protoplasts of Aspergillus fumigatus , a major fungal pathogen, as a model to evaluate EV production in the absence of a cell wall. Our results demonstrated that wall-less A. fumigatus exports plasma membrane-derived EVs containing a complex combination of proteins and glycans. Our study is the first to characterize fungal EVs in the absence of a cell wall. Our results suggest that protoplasts are a promising model for functional studies of fungal vesicles.

Abstract Mitochondria are paramount to the metabolism and survival of cardiomyocytes. Here we show that Mitochondrial Fission Process 1 (MTFP1) is essential for cardiac structure and function. Constitutive knockout of cardiomyocyte MTFP1 in mice resulted in adult-onset dilated cardiomyopathy (DCM) characterized by sterile inflammation and cardiac fibrosis that progressed to heart failure and middle-aged death. Failing hearts from cardiomyocyte-restricted knockout mice displayed a general decline in mitochondrial gene expression and oxidative phosphorylation (OXPHOS) activity. Pre-DCM, we observed no defects in mitochondrial morphology, content, gene expression, OXPHOS assembly nor phosphorylation dependent respiration. However, knockout cardiac mitochondria displayed reduced membrane potential and increased non-phosphorylation dependent respiration, which could be rescued by pharmacological inhibition of the adenine nucleotide translocase ANT. Primary cardiomyocytes from pre-symptomatic knockout mice exhibited normal excitation-contraction coupling but increased sensitivity to programmed cell death (PCD), which was accompanied by an opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP). Intriguingly, mouse embryonic fibroblasts deleted for Mtfp1 recapitulated PCD sensitivity and mPTP opening, both of which could be rescued by pharmacological or genetic inhibition of the mPTP regulator Cyclophilin D. Collectively, our data demonstrate that contrary to previous in vitro studies, the loss of the MTFP1 promotes mitochondrial uncoupling and increases cell death sensitivity, causally mediating pathogenic cardiac remodeling.

Abstract The hijacking of CRM1 export is an important step of the retroviral replication cycle. Here, we investigated the consequences of this hijacking for the host. During HTLV-1 infection, we identified the formation of a complex composed of Rex, CRM1 and the RNA helicase UPF1, leading to the nuclear retention of UPF1. We further showed how this leads to the inhibition of the nonsense mediated mRNA decay (NMD), known to have an antiviral function. Corroborating these results, we described a similar process with Rev, the functional homolog of Rex from HIV-1. Unexpectedly, we also found that, for HTLV-1, this process is coupled with the specific loading of UPF1 onto vRNA, independently of NMD. In this latter context, UPF1 positively regulates several steps of the viral replication cycle, from the nuclear export of vRNA to the production of mature viral particles.

Cell shape and cell-envelope integrity of bacteria are determined by the peptidoglycan cell wall. In rod-shaped Escherichia coli , two conserved sets of machinery are essential for cell-wall insertion in the cylindrical part of the cell, the Rod complex and the class-A penicillin-binding proteins (aPBPs). While the Rod complex governs rod-like cell shape, aPBP function is less well understood. aPBPs were previously hypothesized to either work in concert with the Rod complex or to independently repair cell-wall defects. First, we demonstrate through modulation of enzyme levels that class-A PBPs do not contribute to rod-like cell shape but are required for mechanical stability, supporting their independent activity. By combining measurements of cell-wall stiffness, cell-wall insertion, and PBP1b motion at the single-molecule level we then demonstrate that PBP1b, the major class-A PBP, contributes to cell-wall integrity by localizing and inserting peptidoglycan in direct response to local cell-wall defects.

Abstract NF-κB driven cellular immunity is essential for both pro- and anti-inflammatory responses to microbes, which makes it one of the most frequently targeted pathways by bacteria during pathogenesis. How NF-κB tunes the epithelial response to Streptococcus pneumoniae across the spectrum of commensal to pathogenic outcomes is not fully understood. In this study, we compare a commensal-like 6B ST90 strain to an invasive TIGR4 isolate and demonstrate that TIGR4 both blunts and antagonizes NF-κB activation. We identified, through comparative mass spectrometry of the p65 interactome, that the 6B ST90 isolate drives a non-canonical NF-κB RelB cascade, whereas TIGR4 induces p65 degradation though aggrephagy. Mechanistically, TIGR4 challenge triggers a novel interaction of COMMD2 with p65 and p62. This complex mediates export of p65 for degradation and is necessary for repressing host inflammatory transcription. With these results, we reveal for the first time a new bacterial pathogenesis mechanism to repress host inflammatory response though COMMD2 mediated turnover of p65, and present a paradigm for diverging NF-κB responses to pneumococcus.

Abstract Tunneling nanotubes (TNTs) connect distant cells and mediate cargo transfer for intercellular communication in physiological and pathological contexts. How cells generate these actin-mediated protrusions to span lengths beyond those attainable by canonical filopodia remains unknown. Through a combination of micropatterning, microscopy and optical tweezer-based approaches, we demonstrate that TNTs forming through the outward extension of actin (not through cellular dislodgement) achieve distances greater than the mean length of filopodia, and that branched Arp2/3-dependent pathways attenuate the extent to which actin polymerizes in nanotubes, limiting TNT occurrence. Proteomic analysis using Epidermal growth factor receptor kinase substrate 8 (Eps8) as a positive effector of TNTs showed that upon Arp2/3 inhibition, proteins enhancing filament turnover and depolymerization were reduced and Eps8 instead exhibited heightened interactions with the inverted Bin/Amphiphysin/Rvs (I-BAR) domain protein IRSp53 that provides a direct connection with linear actin polymerases. Our data reveals how common protrusion players (Eps8 and IRSp53) form TNTs, and that when competing pathways overutilizing such proteins and monomeric actin in Arp2/3 networks are inhibited, processes promoting linear actin growth dominate to favour TNT formation. Thus, this work reinforces a general principle for actin network control for cellular protrusions where simple shifts in the balance between processes that inhibit actin growth versus those that promote growth dictate protrusion formation and the ultimate length scales protrusions achieve.