Here we present the first diploid genome sequence of an Asian individual. The genome was sequenced to 36-fold average coverage using massively parallel sequencing technology. We aligned the short reads onto the NCBI human reference genome to 99.97% coverage, and guided by the reference genome, we used uniquely mapped reads to assemble a high-quality consensus sequence for 92% of the Asian individual’s genome. We identified approximately 3 million single-nucleotide polymorphisms (SNPs) inside this region, of which 13.6% were not in the dbSNP database. Genotyping analysis showed that SNP identification had high accuracy and consistency, indicating the high sequence quality of this assembly. We also carried out heterozygote phasing and haplotype prediction against HapMap CHB and JPT haplotypes (Chinese and Japanese, respectively), sequence comparison with the two available individual genomes (J. D. Watson and J. C. Venter), and structural variation identification. These variations were considered for their potential biological impact. Our sequence data and analyses demonstrate the potential usefulness of next-generation sequencing technologies for personal genomics. The power of the latest massively parallel synthetic DNA sequencing technologies is demonstrated in two major collaborations that shed light on the nature of genomic variation with ethnicity. The first describes the genomic characterization of an individual from the Yoruba ethnic group of west Africa. The second reports a personal genome of a Han Chinese, the group comprising 30% of the world's population. These new resources can now be used in conjunction with the Venter, Watson and NIH reference sequences. A separate study looked at genetic ethnicity on the continental scale, based on data from 1,387 individuals from more than 30 European countries. Overall there was little genetic variation between countries, but the differences that do exist correspond closely to the geographic map. Statistical analysis of the genome data places 50% of the individuals within 310 km of their reported origin. As well as its relevance for testing genetic ancestry, this work has implications for evaluating genome-wide association studies that link genes with diseases.

Alternative polyadenylation (APA) is a major layer of gene regulation. However, it has recently been argued that most APA represents molecular noise. To clarify their functional relevance and evolution, we quantified allele-specific APA patterns in multiple tissues from an F1 hybrid mouse. We found a clearly negative correlation between gene expression and APA diversity for the 2,866 genes (24.9%) with a dominant polyadenylation site (PAS) usage above or equal to 90%, suggesting that their other PASs represent molecular errors. Among the remaining genes with multiple PASs, 3,971 genes (34.5%) express two or more isoforms with potentially functional importance. Interestingly, the genes with potentially functional minor PASs specific to neuronal tissues often express two APA isoforms with distinct subcellular localizations. Furthermore, our analysis of cis-APA divergence shows its pattern across tissues is distinct from that of gene expression. Finally, we demonstrate that the relative usage of alternative PASs is not only affected by their cis-regulatory elements, but also by potential coupling between transcriptional and APA regulation as well as competition kinetics between alternative sites.

Abstract Callus is a reprogrammed transitional cell mass during plant regeneration. Pluripotent callus cells develop into fertile shoots through de novo shoot organogenesis. This study represents a pioneering effort in exploring the spatial transcriptome of tomato callus during shoot regeneration, using technologies including BGI Stereo-seq, BMKMANU S1000, and 10x Visium. The results indicate that the callus comprises highly heterogeneous cells, classified into various cell types based on spatial gene expression and histological observation, including epidermis, shoot primordium, vascular tissue, inner callus, and outgrowth shoots. The developmental trajectories from shoot primordium to outgrowth shoot are traced, and vascular tissue development is characterized. The single-cell resolution spatial approach reveals the origin of shoot primordia from the sub-epidermis. The spatial full length RNA sequencing shows high incompletely spliced (IS) ratios in the shoot primordium cells. These findings enhance our knowledge of plant organogenesis and highlight the significance of spatial biology in plant research.

CRISPR/Cas-based transcriptional activators can be enhanced by intrinsically disordered regions (IDRs). However, the underlying mechanisms are still debatable. Here, we examine 12 well-known IDRs by fusing them to the dCas9-VP64 activator, of which only seven can augment activation, albeit independently of their phase separation capabilities. Moreover, modular domains (MDs), another class of multivalent molecules, though ineffective in enhancing dCas9-VP64 activity on their own, show substantial enhancement in transcriptional activation when combined with dCas9-VP64-IDR. By varying the number of gRNA binding sites and fusing dCas9-VP64 with different IDRs/MDs, we uncover that optimal, rather than maximal, cis-trans cooperativity enables the most robust activation. Finally, targeting promoter-enhancer pairs yields synergistic effects, which can be further amplified via enhancing chromatin interactions. Overall, our study develops a versatile platform for efficient gene activation and sheds important insights into CRIPSR-based transcriptional activators enhanced with multivalent molecules. Multivalent interactions are crucial in transcriptional regulation. Here, by integrating specific multivalent molecules into dCas9-based activators, the authors provide valuable strategies to refine CRISPRa applications and achieve highly efficient gene transcription.

Abstract The dysregulation of transcription factors is widely associated with tumorigenesis. As the most well-defined transcription factor in multiple types of cancer, c-Myc can directly transform cells by transactivating various downstream genes. Given that there is no effective way to directly inhibit c-Myc, c-Myc targeting strategies based on its regulatory mechanism hold great potential for cancer therapy. In this study, we found that WSB1, a direct target gene of c-Myc, can positively regulate c-Myc expression, which forms a feedforward circuit promoting cancer development. Luciferase-based promoter activity assays and RNA sequencing results confirmed that WSB1 promoted c-Myc expression through the β-catenin pathway. Mechanistically, WSB1 affected β-catenin destruction complex-PPP2CA assembly and E3 ubiquitin ligase adaptor β-TRCP recruitment, which inhibited the ubiquitination of β-catenin and subsequently transactivated c-Myc. Of interest, the promoting effect of WSB1 on c-Myc was independent of its E3 ligase activity. Moreover, co-expression of WSB1 and c-Myc strongly enhanced the initiation and progression of tumours both in vitro and in vivo . Thus, our findings revealed a novel mechanism involved in tumorigenesis in which the WSB1/c-Myc feedforward circuit played an essential role, highlighting a potential c-Myc intervention strategy in cancer treatment.

Abstract Cellular RNA is decorated with over 170 types of chemical modifications. Many modifications in mRNA, including m 6 A and m 5 C, have been associated with critical cellular functions under physiological and/or pathological conditions. To understand the biological functions of these modifications, it is vital to identify the regulators that modulate the modification rate. However, a high-throughput method for unbiased screening of these regulators is so far lacking. Here, we report such a method combining pooled CRISPR screen and reporters with RNA modification readout, termed C RISPR i ntegrated g RNA a nd r eporter sequencing (CIGAR-seq). Using CIGAR-seq, we discovered NSUN6 as a novel mRNA m 5 C methyltransferase. Subsequent mRNA bisulfite sequencing in HAP1 cells without or with NSUN6 and/or NSUN2 knockout showed that NSUN6 and NSUN2 worked on non-overlapping subsets of mRNA m 5 C sites, and together contributed to almost all the m 5 C modification in mRNA. Finally, using m 1 A as an example, we demonstrated that CIGAR-seq can be easily adapted for identifying regulators of other mRNA modification.

Abstract Sample multiplexing facilitates single cell sequencing by reducing costs, revealing subtle difference between similar samples, and identifying artifacts such as cell doublets. However, universal and cost-effective strategies are rather limited. Here, we reported a Concanavalin A-based Sample Barcoding strategy (CASB), which could be followed by both single-cell mRNA and ATAC (assay for transposase accessible chromatin) sequencing techniques. The method involves minimal sample processing, thereby preserving intact transcriptomic or epigenomic patterns. We demonstrated its high labeling efficiency, high accuracy in assigning cells/nuclei to samples regardless of cell type and genetic background, as well as high sensitivity in detecting doublets by two applications: 1) CASB followed by scRNA-seq to track the transcriptomic dynamics of a cancer cell line perturbed by multiple drugs, which revealed compound-specific heterogeneous response; 2) CASB together with both snATAC-seq and scRNA-seq to illustrate the IFN-γ-mediated dynamic changes on epigenome and transcriptome profile, which identified the transcription factor underlying heterogeneous IFN-γ response.

Abstract The broad application of large-scale single-cell RNA profiling in plants has been restricted by the prerequisite of protoplasting. We recently found that the Arabidopsis nucleus contains abundant polyadenylated mRNAs, many of which are incompletely spliced. To capture the isoform information, we combined 10x Genomics and Nanopore long-read sequencing to develop a protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling method in plants. Our results demonstrated using Arabidopsis root that nuclear mRNAs faithfully retain cell identity information, and single-molecule full-length RNA sequencing could further improve cell type identification by revealing splicing status and alternative polyadenylation at single-cell level.

Fungal effectors play a crucial role in the interaction between pathogenic fungi and their hosts. These interactions directly influence the invasion and spread of pathogens, and the development of diseases. Common in fungal extracellular membrane (CFEM) effectors are closely associated with the pathogenicity, cell wall stability, and pathogenic processes of pathogenic fungi. The aim of this study was to investigate the role of CFEM proteins in Neostagonosporella sichuanensis in pathogen-host interactions. We retrieved 19 proteins containing CFEM structural domains from the genome of N. sichuanensis . By systematic analysis, five NsCFEM proteins had signal peptides but lacked transmembrane structural domains, and thus were considered as potential effectors. Among them, NsCFEM1 and NsCFEM2 were successfully cloned and their functions were further investigated. The validation results show that NsCFEM1 was localized in the cell membrane and nucleus, whereas NsCFEM2 was exclusively observed in the cell membrane. Both were identified as secreted proteins. Additionally, NsCFEM1 inhibited Bax-induced programmed cell death in Nicotiana benthamiana , whereas NsCFEM2 did not induce or inhibit this response. NsCFEM1 was implicated as a virulence factor that contributes to fungal growth, development, stress response, and pathogenicity. NsCFEM2 was implicated in maintenance of cell wall stability. This study lays a foundation for elucidating the role of CFEM proteins in the pathogen of fishscale bamboo rhombic-spot caused by N. sichuanensis . In particular, the functional studies of NsCFEM1 and NsCFEM2 revealed their potential roles in the interaction between N. sichuanensis and the host Phyllostachys heteroclada .