SUMMARY Extracellular capsules protect the cell against both abiotic and biotic stresses such as bacteriophages and the host immune system. Yet, it is unclear if capsules contribute to fitness in the absence of external aggressions, in spite of the cost of production. Here, we enquire if there are conditions favouring the presence of the capsule in Klebsiella , where it is a major virulence factor. We shortly experimentally evolved 19 different strains, and show that small changes in growth media have a strong impact on the maintenance of the capsule. Competitions with capsule mutants in nine different strains showed that capsules provide ∼20% of fitness advantage in nutrient-poor conditions, due to faster growth rates and higher yields. In contrast, the capsule was readily lost in nutrient-rich media. The growth environment, as well as the capsule serotype, strongly influenced the role of the capsule in major virulence traits like hypermucoviscosity and biofilm formation. Our data shows that the capsule is selected for in situations lacking abiotic, but also biotic stresses and further supports that the capsule role in virulence may be a by-product of adaptation outside the host, hinting that it may have important roles in bacterial physiology yet to be discovered. SIGNIFICANCE Bacterial capsules are a wide-spread virulence factor that limits efficacy of antimicrobial therapy. Whereas most studies focus on the role of the capsule in pathogenesis, very few have addressed the conditions under which the capsule is primarily selected for. Here, we show that small changes in growth media have a strong impact in the maintenance of the capsule and the fitness advantage they confer. Our results raise the question whether conditions lacking biotic or abiotic stresses, in addition of selecting for the maintenance of the capsule, can also play a role in selecting for serotype variation. Our results further support that the role of the capsule in virulence may be a by-product of adaptation outside the host, hinting that there may be other functionalities yet to be discovered for it.

ABSTRACT Conjugative plasmids are important drivers of bacterial evolution, but most plasmids lack genes for conjugation. It is currently not known if the latter can transfer because origins of transfer by conjugation ( oriT ), which would allow their mobilization by conjugative plasmids, are poorly known. Here, we identify and characterize occurrences of known oriT families across thousands of plasmids confirming that most conjugative and mobilizable plasmids still lack identifiable families of oriTs . They reveal clear patterns in terms of intergenic position, distance to the relaxases, and MOB-type association. This allowed to develop a computational method to discover novel oriT s. As a proof of concept, we identify 21 novel oriTs from the nosocomial pathogens Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae , and Acinetobacter baumannii , some of them responsible for the mobility of critical antimicrobial resistance genes. These 21 oriT families share key characteristics of the others and fill most of the missing diversity of oriTs in relaxase-encoding plasmids both in terms of frequency and phylogeny. We confirmed experimentally the function of six of them. The ability to identify novel oriT s paves the way to explore conjugation across bacterial plasmids, notably among the majority lacking conjugation-related genes.

ABSTRACT Adaptation to one environment can often generate phenotypic and genotypic changes which impact the future ability of an organism to thrive in other environmental conditions. In the context of host-microbe interactions, biofilm formation can increase survival rates in vivo upon exposure to stresses, like the host’s immune system or antibiotic therapy. However, how the generic process of adaptation impacts the ability to form biofilm and how it may change through time has seldomly been studied. To do so, we used a previous evolution experiment with three strains of the Klebsiella pneumoniae species complex, in which we did not specifically select for biofilm formation. We observed that changes in the ability to form biofilm happened very fast at first and afterwards reverted to ancestral levels in many populations. Biofilm changes were associated to phenotypic changes in population yield and surface polysaccharide production. Genotypically, mutational targets in the tip adhesin of type III fimbriae ( mrkD ) or the fim switch of type I fimbriae were driven by nutrient availability during evolution, and their impact on biofilm formation was dependent on capsule production. Analyses of natural isolates revealed similar mutations in mrkD , suggesting that they also play an important role in adaptation outside the laboratory. Our work reveals that the latent evolution of biofilm formation, and its evolutionary dynamics, depend on nutrient availability, the genetic background and other intertwined phenotypic and genotypic changes. Ultimately, it suggests that small differences in the environment can alter an organism’s fate in more complex niches like the host.

Summary Bacterial evolution is affected by mobile genetic elements such as phages and conjugative plasmids, which may provide novel adaptive traits but also incur in fitness costs. Infection by these elements is affected by the bacterial capsule. Yet, its importance has been difficult to quantify and characterise because of the high diversity of bacterial genomes regarding confounding mechanisms such as anti-viral systems. We swapped capsule loci between Klebsiella pneumoniae strains to quantify their effect on transfer of conjugative plasmids and phages independently of the genetic background. Capsule swaps systematically invert phage susceptibility, demonstrating that serotypes are key determinants of phage infection. Capsule types also affect conjugation efficiency in both donor and recipient cells depending on the serotype, a mechanism shaped by the capsule volume and depending on the structure of the conjugative pilus. Comparative genomics confirmed that more permissive serotypes in the lab correspond to the strains acquiring more conjugative plasmids in nature. The pili least sensitive to capsules (F-like) are also the most frequent in the species’ plasmids, and are the only ones associated with both antibiotic resistance and virulence factors, driving the convergence between virulence and antibiotics resistance in the population. These results show how the traits of cellular envelopes define slow and fast lanes of infection by mobile genetic elements, with implications for population dynamics and horizontal gene transfer. Graphical abstract

ABSTRACT Mobile genetic elements (MGEs) drive genetic transfers between bacteria using mechanisms that are affected by the cell envelope composition, notably the capsule. Here, we show that capsules constrain phage-mediated gene flow between closely related serotypes in Klebsiella pneumoniae , a high-priority nosocomial enterobacteria. Serotype-specific phage pressure may also explain the inactivation of capsule genes, which occur frequently and recapitulate the capsule biosynthetic pathway. We show that plasmid conjugation is increased upon capsule inactivation and that capsule re-acquisition leaves long recombination tracts around the capsular locus. This suggests that capsule inactivation by phage pressure facilitates its subsequent re-acquisition by conjugation, a process re-wiring gene flow towards novel lineages whenever it leads to serotype swaps. These results reveal the basis of trade-offs between the evolution of virulence and multidrug resistance. They also caution that some alternatives to antibiotic therapy may select for capsule inactivation, thus decreasing virulence but facilitating antibiotic resistance genes acquisition.

Klebsiella species are able to colonize a wide range of environments and include daunting nosocomial pathogens. Here, we sought to determine the abundance and infectivity of prophages of Klebsiella to understand how the interactions between induced prophages and bacteria affect population dynamics and evolution. We identified many prophages in the species, placing these taxa among the top 5% of the most polylysogenic bacteria. We selected 35 representative strains of Klebsiella to establish a network of induced phage-bacteria interactions. This revealed that many prophages are able to enter the lytic cycle, and subsequently kill or lysogenize closely-related Klebsiella strains. Although 60% of the tested strains could produce phages that infect at least one other strain, the interaction network of all pairwise cross-infections is very sparse, most interactions are null, and is modular because of the capsule serotype. Capsule mutants remain uninfected showing that the capsule is required for successful infection. Accordingly, experiments where bacteria are predated by their own prophages result in accelerated loss of the capsule. Our results show that infectiousness defines interaction modules between small subsets of phages and bacteria in function of capsule serotype. This limits the role of prophages as competitive weapons because they can infect very few strains of the species. This should also restrict phage-driven gene flow across the species. However, if capsule loss driven by phage predation is followed by the acquisition of a novel capsule, then bacteria shift to another module where they can be infected by other phages that can transduce genes from other bacterial strains.

ABSTRACT Klebsiella variicola is an emergent human pathogen causing diverse infections, including in the urinary tract. However, little is known about the evolution and maintenance of genetic diversity in this species, the molecular mechanisms and their population dynamics. Here, we characterized the emergence of a novel rdar-like morphotype which is contingent both on the genetic background and the environment. We show that mutations in either the nitrogen assimilation control gene (nac) or the type III fimbriae regulator, mrkH, suffice to generate rdar-like colonies. These morphotypes are primarily selected for the reduced inter-cellular aggregation as a result of loss-of-function yielding reduced fimbriae expression. Additionally, these clones also display increased growth rate and reduced biofilm formation. Direct competitions between rdar and wild type clone show that mutations in mrkH provide large fitness advantages. In artificial urine, the morphotype is under strong negative frequency-dependent selection and is able to socially exploit wild type strains. An exhaustive search for mrkH mutants in public databases revealed that ca 8% of natural isolates analysed had truncated MrkH proteins many of which were due to insertions of IS elements, including a reported clinical isolate with rdar morphology. These strains were all isolated from human, mostly from urine. The decreased aggregation of these mutants could have important clinical implications as such clones could better disperse within the host allowing colonisation of other body sites and leading to systemic infections. One-sentence Summary Report of the emergence of a novel non-aggregative colony morphology in K. variicola and the first example of social exploitation in the Klebsiella genus.