Heterologous gene expression can be a significant burden for cells. Here we describe an in vivo monitor that tracks changes in the capacity of Escherichia coli in real time and can be used to assay the burden imposed by synthetic constructs and their parts. We identify construct designs with reduced burden that predictably outperformed less efficient designs, despite having equivalent output.

In this CRISPR-based feedback control system, sgRNA expression is triggered by the burden of protein overexpression, and the sgRNA directs repression of the exogenous gene promoter to reduce burdensome expression and restore growth of the cell. Cells use feedback regulation to ensure robust growth despite fluctuating demands for resources and differing environmental conditions. However, the expression of foreign proteins from engineered constructs is an unnatural burden that cells are not adapted for. Here we combined RNA-seq with an in vivo assay to identify the major transcriptional changes that occur in Escherichia coli when inducible synthetic constructs are expressed. We observed that native promoters related to the heat-shock response activated expression rapidly in response to synthetic expression, regardless of the construct. Using these promoters, we built a dCas9-based feedback-regulation system that automatically adjusts the expression of a synthetic construct in response to burden. Cells equipped with this general-use controller maintained their capacity for native gene expression to ensure robust growth and thus outperformed unregulated cells in terms of protein yield in batch production. This engineered feedback is to our knowledge the first example of a universal, burden-based biomolecular control system and is modular, tunable and portable.

Abstract Synthetic molecular circuits implementing DNA or RNA strand-displacement reactions can be used to build complex systems such as molecular computers and feedback control systems. Despite recent advances, application of nucleic acid-based circuits in vivo remains challenging due to a lack of efficient methods to produce their essential components – multi-stranded complexes known as “gates” – in situ , i.e. in living cells or other autonomous systems. Here, we propose the use of naturally occurring self-cleaving ribozymes to cut a single-stranded RNA transcript into a gate complex of shorter strands, thereby opening new possibilities for the autonomous and continuous production of RNA strands in a stoichiometrically and structurally controlled way.

Toehold-mediated strand displacement (TMSD) is a nucleic acid-based reaction wherein an invader strand ( I ) replaces an incumbent strand ( N ) in a duplex with a target strand ( T ). TMSD is driven by toeholds, overhanging single-stranded domains in T recognised by I . Although TMSD is responsible for the outstanding potential of dynamic DNA nanotechnology 1, 2 , TMSD cannot implement templating, the central mechanism by which biological systems generate complex, far-from equilibrium assemblies like RNA or proteins 3, 4 . Therefore, we introduce handhold-mediated strand displacement (HMSD). Handholds are toehold analogues located in N and capable of implementing templating. We measure the kinetics of 98 different HMSD systems to demonstrate that handholds can accelerate the rate of invader-target ( IT ) binding by more than 4 orders of magnitude. Furthermore, handholds of moderate length accelerate reactions whilst allowing detachment of the product IT from N . We are thus able to experimentally demonstrate the use of HMSD-based templating to produce highly-specific far-from-equilibrium DNA duplexes.

Abstract Predicting the evolution of engineered cell populations is a highly soughtafter goal in biotechnology. While models of evolutionary dynamics are far from new, their application to synthetic systems is scarce where the vast combination of genetic parts and regulatory elements creates a unique challenge. To address this gap, we herein present a framework that allows one to connect the DNA design of varied genetic devices with mutation spread in a growing cell population. Users can specify the functional parts of their system and the degree of mutation heterogeneity to explore, after which our model generates hostaware transition dynamics between different mutation phenotypes over time. We show how our framework can be used to generate insightful hypotheses across broad applications, from how a device’s components can be tweaked to optimise longterm protein yield and genetic shelf life, to generating new design paradigms for gene regulatory networks that improve their functionality.

Heterologous gene expression can be a significant burden to cells, consuming resources and causing decreased growth and stability. We describe here an in vivo monitor that tracks E. coli capacity changes in real-time and can be used to assay the burden synthetic constructs and their parts impose. By measuring capacity, construct designs with reduced burden can be identified and shown to predictably outperform less efficient designs, despite having equivalent expression outputs.

Affordable, easy-to-use diagnostic tests that can be readily deployed for point-of-care (POC) testing are key in addressing challenges in the diagnosis of medical conditions and for improving global health in general. Ideally, POC diagnostic tests should be highly selective for the biomarker, user-friendly, have a flexible design architecture and a low cost of production. Here we developed a novel agglutination assay based on whole E. coli cells surface-displaying nanobodies which bind selectively to a target protein analyte. As a proof-of-concept, we show the feasibility of this design as a new diagnostic platform by the detection of a model analyte at nanomolar concentrations. Moreover, we show that the design architecture is flexible by building assays optimized to detect a range of model analyte concentrations supported using straight-forward design rules and a mathematical model. Finally, we re-engineer E. coli cells for the detection of a medically relevant biomarker by the display of two different antibodies against the human fibrinogen and demonstrate a detection limit as low as 10 pM in diluted human plasma. Overall, we demonstrate that our agglutination technology fulfills the requirement of POC testing by combining low-cost nanobody production, customizable detection range and low detection limits. This technology has the potential to produce affordable diagnostics for both field-testing in the developing world, emergency or disaster relief sites as well as routine medical testing and personalized medicine.

Advancing synthetic biology to the multicellular level requires the development of multiple orthogonal cell-to-cell communication channels to propagate information with minimal signal interference. The development of quorum sensing devices, the cornerstone technology for building microbial communities with coordinated system behaviour, has largely focused on reducing signal leakage between systems of cognate AHL/transcription factor pairs. However, the use of non-cognate signals as a design feature has received limited attention so far. Here, we demonstrate the largest library of AHL-receiver devices constructed to date with all cognate and non-cognate chemical signal interactions quantified and we develop a software tool that allows automated selection of orthogonal chemical channels. We use this approach to identify up to four orthogonal channels in silico and experimentally demonstrate the simultaneous use of three channels in co-culture. The development of multiple non-interfering cell-to-cell communication channels will facilitate the design of synthetic microbial consortia for novel applications including distributed bio-computation, increased bioprocess efficiency, cell specialisation, and spatial organisation.

Synthetic genes compete among themselves and with the host cell's genes for expression machinery, exhibiting resource couplings that affect the dynamics of cellular processes. The modeling of such couplings can be facilitated by simplifying the kinetics of resource-substrate binding. Model-guided design allows to counter unwanted indirect interactions by using biomolecular controllers or tuning the biocircuit's parameters. However, resource-aware biocircuit design in bacteria is complicated by the interdependence of resource availability and cell growth rate, which significantly affects biocircuit performance. This phenomenon can be captured by coarse-grained models of the whole bacterial cell. The level of detail in these models must balance accurate representation of metabolic regulation against model simplicity and interpretability. We propose a coarse-grained E. coli cell model that combines the ease of simplified resource coupling analysis with the appreciation of bacterial growth regulation mechanisms. Reliably capturing known growth phenomena, it enables numerical prototyping of biocircuits and derivation of analytical relations which can guide the design process. By reproducing several distinct empirical laws observed in prior studies, our model provides a unifying framework for previously disjoint experimental observations. Finally, we propose a novel biomolecular controller that achieves near-perfect adaptation of cell-wide ribosome availability to changes in synthetic gene expression. Showcasing our model's usefulness, we use it to determine the controller's setpoint and operation range from its constituent genes' parameters.

Abstract Microbial consortia have been utilised for centuries to produce fermented foods and have great potential in applications such as therapeutics, biomaterials, fertilisers, and biobased production. Working together, microbes become specialized and perform complex tasks more efficiently, strengthening both cooperation and stability of the microbial community. However, imbalanced proportions of microbial community members can lead to unoptimized and diminished yields in biotechnology. To address this, we developed a burden-aware RNA-based multicellular feedback control system that stabilises and tunes coculture compositions. The system consists of three modules: a quorum sensing-based communication module to provide information about the densities of cocultured strains, an RNA-based comparator module to compare the ratio of densities of both strains to a pre-set desired ratio, and a customisable growth module that relies either on heterologous gene expression or on CRISPRi knockdowns to tune growth rates. We demonstrated that heterologous expression burden could be used to stabilise composition in a two-member E. coli coculture. This is the first coculture composition controller that does not rely on toxins or syntrophy for growth regulation and uses RNA sequestration to stabilise and control coculture composition. This work provides a fundamental basis to explore burden-aware multicellular feedback control strategies for robust stabilisation of synthetic community compositions.