ABSTRACT Numerous in vitro studies have yielded a refined picture of the structural and molecular associations between Cyclic-AMP receptor protein (Crp), the DNA motif, and RNA polymerase (RNAP) holoenzyme. In this study, high-resolution ChIP-exonuclease (ChIP-exo) was applied to study Crp binding in vivo and at genome-scale. Surprisingly, Crp was found to provide little to no protection of the DNA motif under activating conditions. Instead, Crp demonstrated binding patterns that closely resembled those generated by σ 70 . The binding patterns of both Crp and σ 70 are indicative of RNAP holoenzyme DNA footprinting profiles associated with stages during transcription initiation that occur post-recruitment. This is marked by a pronounced advancement of the template strand footprint profile to the +20 position relative to the transcription start site and a multimodal distribution on the nontemplate strand. This trend was also observed in the familial transcription factor, Fnr, but full protection of the motif was seen in the repressor ArcA. Given the time-scale of ChIP studies and that the rate-limiting step in transcription initiation is typically post recruitment, we propose a hypothesis where Crp is absent from the DNA motif but remains associated with RNAP holoenzyme post-recruitment during transcription initiation. The release of Crp from the DNA motif may be a result of energetic changes that occur as RNAP holoenzyme traverses the various stable intermediates towards elongation complex formation.

Abstract Escherichia coli is a common host for biotechnology and synthetic biology applications. During growth and fermentation, the microbes are often exposed to stress conditions, like variations in pH or solvent concentrations and it has been described that bacterial membranes play a key role in response to abiotic stresses. Ornithine lipids (OLs) are a group of membrane lipids whose presence and synthesis have been related to stress resistance in different bacteria. In this study, we engineered different E. coli strains to produce unmodified OLs and hydroxylated OLs by expressing the synthetic operon olsFC . Our results showed that OL formation improved pH resistance and increased biomass under phosphate limitation. Transcriptome analysis revealed that OL-forming strains differentially expressed stress and membrane-related genes. OL-producing strains also showed better growth in the presence of the ionophore carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP), suggesting reduced proton leakiness. Furthermore, our engineered strains showed improved heterologous violacein production at phosphate limitation and low pH. Overall, this study demonstrates the potential of engineering the E. coli membrane composition for constructing robust hosts for biotechnology and synthetic biology applications. Abstract Figure Graphical abstract. Escherichia coli strains forming ornithine lipids in addition to glycerophospholipids show increased resistance to acidic pH, improved growth under phosphate-limiting conditions, and allowed a higher production of violacein in a heterologous expression system. Transcriptional profiling by RNAseq showed expression changes that suggest reduced proton leakiness explained by CCCP tolerance.

Palm wine is obtained by fermentation of palm tree sap. In the Pacific coast of Mexico, palm wine is called Tuba and it is consumed as a traditional fermented beverage. Tuba has empirical applications such as an auxiliary in gastrointestinal diseases and a good source of nutrients. In the present study, a next-generation sequencing of the V3-V4 regions of the 16S rRNA gene was employed to analyze bacterial diversity and population dynamics during the fermentation process of Tuba, both in laboratory controlled conditions and in commercial samples from local vendors. Taxonomic identification showed that Fructobacillus was the main genus in all the samples, following by Leuconostoc, Gluconacetobacter, Sphingomonas, and Vibrio. Alpha diversity analysis demonstrated variability between all the samples. Beta diversity clustered the bacterial population according to the collection origin of the sample. Metabolic functional profile inference showed that the members of the bacterial communities may present the vitamin, antibiotic and antioxidant biosynthesis genes. Additionally, we further investigated the correlation between the predominant genera and some composition parameters of this beverage. This study provides the basis of the bacterial community composition and functionality of the fermented beverage.

Growth rate and yield are fundamental features of microbial growth. However, we lack a mechanistic and quantitative understanding of the rate-yield relationship. Studies pairing computational predictions with experiments have shown the importance of maintenance energy and proteome allocation in explaining rate-yield tradeoffs and overflow metabolism. Recently, adaptive evolution experiments of Escherichia coli reveal a phenotypic diversity beyond what has been explained using simple models of growth rate versus yield. Here, we identify a two-dimensional rate-yield tradeoff in adapted E. coli strains where the dimensions are (A) a tradeoff between growth rate and yield and (B) a tradeoff between substrate (glucose) uptake rate and growth yield. We employ a multi-scale modeling approach, combining a previously reported small-scale proteome allocation model with a genome-scale model of metabolism and gene expression (ME-model), to develop a quantitative description of the full rate-yield relationship for E. coli K-12 MG1655. The analysis of the genome-scale model shows that the rate-yield tradeoffs that govern microbial adaptation to new environments are more complex than previously reported.

Engineering resource allocation in biological systems for synthetic biology applications is an ongoing challenge. Wild type organisms allocate abundant cellular resources for ensuring survival in changing environments, reducing the productivity of engineered functions. Here we present a novel approach for engineering the resource allocation of Escherichia coli by rationally modifying the transcriptional regulatory network of the bacterium. Our method (ReProMin) identifies the minimal set of genetic interventions that maximise the savings in cell resources that would normally be used to express non-essential genes. To this end we categorize Transcription Factors (TFs) according to the essentiality of the genes they regulate and we use available proteomic data to rank them based on its proteomic balance, defined as the net proteomic charge they release. Using a combinatorial approach, we design the removal of TFs that maximise the release of the proteomic charge and we validate the model predictions experimentally. Expression profiling of the resulting strain shows that our designed regulatory interventions are highly specific. We show that our resulting engineered strain containing only three mutations, theoretically releasing 0.5% of their proteome, has higher proteome budget and show increased production yield of a molecule of interest obtained from a recombinant metabolic pathway. This approach shows that combining whole-cell proteomic and regulatory data is an effective way of optimizing strains in a predictable way using conventional molecular methods.Importance Biological regulatory mechanisms are complex and occur in hierarchical layers such as transcription, translation and post-translational mechanisms. We foresee the use of regulatory mechanism as a control layer that will aid in the design of cellular phenotypes. Our ability to engineer biological systems will be dependent on the understanding of how cells sense and respond to their environment at a system level. Few studies have tackled this issue and none of them in a rational way. By developing a workflow of engineering resource allocation based on our current knowledge of E. coli ’s regulatory network, we pursue the objective of minimizing cell proteome using a minimal genetic intervention principle. We developed a method to rationally design a set of genetic interventions that reduce the hedging proteome allocation. Using available datasets of a model bacterium we were able to reallocate parts of the unused proteome in laboratory conditions to the production of an engineered task. We show that we are able to reduce the unused proteome (theoretically 0.5%) with only three regulatory mutations designed in a rational way, which results in strains with increased capabilities for recombinant expression of pathways of interest.Highlights

Summary Bacteria regulate their cellular resource allocation to enable fast growth-adaptation to a variety of environmental niches. We studied the ribosomal allocation, growth and expression profiles of two sets of fast-growing mutants of Escherichia coli K-12 MG1655 in glucose minimal medium. Mutants with only 3 of the seven copies of ribosomal RNA operons grew faster than the wild-type strain in minimal media and show similar phenotype to previously studied rpoB mutants. Higher growth rates due to increased ribosome content affected resource allocation. Expression profiles of fast-growing mutants shared downregulation of hedging functions and upregulated growth functions. Mutants showed longer diauxic shifts and reduced activity of gluconeogenic promoters during glucose-acetate shifts, suggesting reduced availability of the RNA Polymerase for expressing hedging proteome. These results show that the regulation of ribosomal allocation underlies the growth/hedging phenotypes obtained from laboratory evolution experiments. We show how two different regulatory perturbations (rRNA promoters or rpoB mutations) reshape the proteome for growth with a concomitant fitness cost Highlights Mutants with only 3 ribosomal operons grow faster than wild-type in minimal medium Δ4 rrn and rpoB mutants share phenotypic traits Faster growth of mutants is achieved by increased ribosome content Fast-growing mutants display reduced hedging expression and adaptation trade-offs Despite similar ribosomal content in rich medium the mutants present growth defects