Lipid nanoparticle (LNP) delivery of CRISPR ribonucleoproteins (RNPs) has the potential to enable high-efficiency in vivo genome editing with low toxicity and an easily manufactured technology, if RNP efficacy can be maintained during LNP production. In this study, we engineered a thermostable Cas9 from Geobacillus stearothermophilus (GeoCas9) using directed evolution to generate iGeoCas9 evolved variants capable of robust genome editing of cells and organs. iGeoCas9s were significantly better at editing cells than wild-type GeoCas9, with genome editing levels >100X greater than those induced by the native GeoCas9 enzyme. Furthermore, iGeoCas9 RNP:LNP complexes edited a variety of cell lines and induced homology-directed repair (HDR) in cells receiving co-delivered single-stranded DNA (ssDNA) templates. Using tissue-selective LNP formulations, we observed genome editing of 35‒56% efficiency in the liver or lungs of mice that received intravenous injections of iGeoCas9 RNP:LNPs. In particular, iGeoCas9 complexed to acid-degradable LNPs edited lung tissue in vivo with an average of 35% efficiency, a significant improvement over editing efficiencies observed previously using viral or non-viral delivery strategies. These results show that thermostable Cas9 RNP:LNP complexes are a powerful alternative to mRNA:LNP delivery vehicles, expanding the therapeutic potential of genome editing.

Objective: Protein extraction methods play a crucial role in the quality, functionality, and recovery efficiency of protein products, and directly affect their subsequent applications. Hemp seeds are rich in proteins and oils; however, the process of hemp seed protein extraction has rarely been studied. To bridge this knowledge gap, we aimed to explore the effects of the extraction conditions on the yield, physicochemical characteristics, functional properties, and biological activities of hemp seed proteins. Methods: Alkaline extraction (AE), AE combined with ultrasonication (AEU), salt extraction (SE), and SE combined with ultrasonication (SEU) were used to extract the hemp seed proteins. The protein yields of SE and SEU were significantly higher than those of AE and AEU. All four types of protein extracts showed no obvious differences in protein purity, which was higher than 95%; however, significant differences were observed in protein physicochemical properties, functional properties, and biological activities among the proteins obtained by the four extraction methods. The hemp seed proteins extracted by the SE (designated as HPS) and SEU (designated as HPSU) methods possessed better nutritional quality, digestion properties, higher fat absorption capacity, and a lower water-holding capacity. Moreover, we found that the proteolytic products of HPS and HPSU exhibited superior biological activities, including 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl scavenging capacity and dipeptidyl-peptidase IV inhibitory activity, but similar anti-inflammatory activities. We concluded that SE was more suitable for the extraction of hemp seed protein because the SE method maintained the high nutritional value for the proteins. We believe that these findings contribute to a better understanding of the effects of extraction methods on protein quality.

Thermostable CRISPR-Cas9 enzymes could improve genome editing efficiency and delivery due to extended protein lifetimes. However, initial experimentation demonstrated Geobacillus stearothermophilus Cas9 (GeoCas9) to be virtually inactive when used in cultured human cells. Laboratory-evolved variants of GeoCas9 overcome this natural limitation by acquiring mutations in the wedge (WED) domain that produce >100-fold higher genome editing levels. Cryo-EM structures of the wildtype and improved GeoCas9 (iGeoCas9) enzymes reveal extended contacts between the WED domain of iGeoCas9 and DNA substrates. Biochemical analysis shows that iGeoCas9 accelerates DNA unwinding to capture substrates under the magnesium-restricted conditions typical of mammalian but not bacterial cells. These findings enabled rational engineering of other Cas9 orthologs to enhance genome editing levels, pointing to a general strategy for editing enzyme improvement. Together, these results uncover a new role for the Cas9 WED domain in DNA unwinding and demonstrate how accelerated target unwinding dramatically improves Cas9-induced genome editing activity.