The major barrier to research and development of effective interventions for human noroviruses (HuNoVs) has been the lack of a robust and reproducible in vitro cultivation system. HuNoVs are the leading cause of gastroenteritis worldwide. We report the successful cultivation of multiple HuNoV strains in enterocytes in stem cell–derived, nontransformed human intestinal enteroid monolayer cultures. Bile, a critical factor of the intestinal milieu, is required for strain-dependent HuNoV replication. Lack of appropriate histoblood group antigen expression in intestinal cells restricts virus replication, and infectivity is abrogated by inactivation (e.g., irradiation, heating) and serum neutralization. This culture system recapitulates the human intestinal epithelium, permits human host-pathogen studies of previously noncultivatable pathogens, and allows the assessment of methods to prevent and treat HuNoV infections.

In April 2008, a nucleotide-sequence-based, complete genome classification system was developed for group A rotaviruses (RVs). This system assigns a specific genotype to each of the 11 genome segments of a particular RV strain according to established nucleotide percent cutoff values. Using this approach, the genome of individual RV strains are given the complete descriptor of Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx. The Rotavirus Classification Working Group (RCWG) was formed by scientists in the field to maintain, evaluate and develop the RV genotype classification system, in particular to aid in the designation of new genotypes. Since its conception, the group has ratified 51 new genotypes: as of April 2011, new genotypes for VP7 (G20-G27), VP4 (P[28]-P[35]), VP6 (I12-I16), VP1 (R5-R9), VP2 (C6-C9), VP3 (M7-M8), NSP1 (A15-A16), NSP2 (N6-N9), NSP3 (T8-T12), NSP4 (E12-E14) and NSP5/6 (H7-H11) have been defined for RV strains recovered from humans, cows, pigs, horses, mice, South American camelids (guanaco), chickens, turkeys, pheasants, bats and a sugar glider. With increasing numbers of complete RV genome sequences becoming available, a standardized RV strain nomenclature system is needed, and the RCWG proposes that individual RV strains are named as follows: RV group/species of origin/country of identification/common name/year of identification/G- and P-type. In collaboration with the National Center for Biotechnology Information (NCBI), the RCWG is also working on developing a RV-specific resource for the deposition of nucleotide sequences. This resource will provide useful information regarding RV strains, including, but not limited to, the individual gene genotypes and epidemiological and clinical information. Together, the proposed nomenclature system and the NCBI RV resource will offer highly useful tools for investigators to search for, retrieve, and analyze the ever-growing volume of RV genomic data.

Norwalk virus, a noncultivatable human calicivirus, is the major cause of epidemic gastroenteritis in humans. The first x-ray structure of a calicivirus capsid, which consists of 180 copies of a single protein, has been determined by phase extension from a low-resolution electron microscopy structure. The capsid protein has a protruding (P) domain connected by a flexible hinge to a shell (S) domain that has a classical eight-stranded β-sandwich motif. The structure of the P domain is unlike that of any other viral protein with a subdomain exhibiting a fold similar to that of the second domain in the eukaryotic translation elongation factor–Tu. This subdomain, located at the exterior of the capsid, has the largest sequence variation among Norwalk-like human caliciviruses and is likely to contain the determinants of strain specificity and cell binding.

Norwalk virus capsid protein was produced by expression of the second and third open reading frames of the Norwalk virus genome, using a cell-free translation system and baculovirus recombinants. Analysis of the expressed products showed that the second open reading frame encodes a protein with an apparent molecular weight of 58,000 (58K protein) and that this protein self-assembles to form empty viruslike particles similar to native capsids in size and appearance. The antigenicity of these particles was demonstrated by immunoprecipitation and enzyme-linked immunosorbent assays of paired serum samples from volunteers who developed illness following Norwalk virus challenge. These particles also induced high levels of Norwalk virus-specific serum antibody in laboratory animals following parenteral inoculation. A minor 34K protein was also found in infected insect cells. Amino acid sequence analysis of the N terminus of the 34K protein indicated that the 34K protein was a cleavage product of the 58K protein. The availability of large amounts of recombinant Norwalk virus particles will allow the development of rapid, sensitive, and reliable tests for the diagnosis of Norwalk virus infection as well as the implementation of structural studies.

Recently, a classification system was proposed for rotaviruses in which all the 11 genomic RNA segments are used (Matthijnssens et al. in J Virol 82:3204–3219, 2008). Based on nucleotide identity cut-off percentages, different genotypes were defined for each genome segment. A nomenclature for the comparison of complete rotavirus genomes was considered in which the notations Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx are used for the VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/6 encoding genes, respectively. This classification system is an extension of the previously applied genotype-based system which made use of the rotavirus gene segments encoding VP4, VP7, VP6, and NSP4. In order to assign rotavirus strains to one of the established genotypes or a new genotype, a standard procedure is proposed in this report. As more human and animal rotavirus genomes will be completely sequenced, new genotypes for each of the 11 gene segments may be identified. A Rotavirus Classification Working Group (RCWG) including specialists in molecular virology, infectious diseases, epidemiology, and public health was formed, which can assist in the appropriate delineation of new genotypes, thus avoiding duplications and helping minimize errors. Scientists discovering a potentially new rotavirus genotype for any of the 11 gene segments are invited to send the novel sequence to the RCWG, where the sequence will be analyzed, and a new nomenclature will be advised as appropriate. The RCWG will update the list of classified strains regularly and make this accessible on a website. Close collaboration with the Study Group Reoviridae of the International Committee on the Taxonomy of Viruses will be maintained.

Noroviruses are the most common cause of viral gastroenteritis in the United States. To determine the magnitude and duration of virus shedding in feces, we evaluated persons who had been experimentally infected with Norwalk virus. Of 16 persons, clinical gastroenteritis (watery diarrhea and/or vomiting) developed in 11; symptomatic illness lasted 1-2 days. Virus shedding was first detected by reverse transcription-PCR (RT-PCR) 18 hours after participant inoculation and lasted a median of 28 days after inoculation (range 13-56 days). The median peak amount of virus shedding was 95 x 10(9) (range 0.5-1,640 x 10(9)) genomic copies/g feces as measured by quantitative RT-PCR. Virus shedding was first detected by antigen ELISA approximately 33 hours (median 42 hours) after inoculation and lasted 10 days (median 7 days) after inoculation. Understanding of the relevance of prolonged fecal norovirus excretion must await the development of sensitive methods to measure virus infectivity.

The rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 is an intracellular receptor that mediates the acquisition of a transient membrane envelope as subviral particles bud into the endoplasmic reticulum. NSP4 also causes an increase in intracellular calcium in insect cells. Purified NSP4 or a peptide corresponding to NSP4 residues 114 to 135 induced diarrhea in young (6 to 10 days old) CD1 mice. This disease response was age-dependent, dose-dependent, and specific. Electrophysiologic data from intestinal mucosa showed that the NSP4 114–135 peptide potentiates chloride secretion by a calcium-dependent signaling pathway. Diarrhea is induced when NSP4, acting as a viral enterotoxin, triggers a signal transduction pathway.

A library of overlapping cDNAs obtained from Norwalk virus purified from stools of human volunteers (Jiang et al., 1990, Science 250, 1580-1583) was used to obtain the nucleotide sequence of the viral genome. The sequence has a total of 7642 nucleotides, excluding the 3′ poly(A) tail, and has a base composition of 48% G + C. Three open reading frames (ORF) are predicted in the sequence. The longest ORF (ORF1, nucleotides (nt) 146 to 5359) is predicted to encode a polyprotein precursor to nonstructural proteins based on identification of sequences similar to the picornavirus 2C protein, 3C protease, and 3D RNA-dependent RNA polymerase. ORF2 (nt 5346 to 6935) is predicted to encode a polypeptide with a predicted molecular weight of 56,571 (56.6K, close to the expected size of the viral capsid protein), and it contains a short region of sequence similarity to the picornavirus structural protein VP3. A third potential ORF (nt 6938 to 7573) could encode a small polypeptide of 22.5K. The genomic organization found in Norwalk virus shares striking similarities with the genome of two caliciviruses, the feline calicivirus and the rabbit hemorrhagio disease virus. The morphology, size, polarity, and genomic organization of the Norwalk virus indicate it is a member of the Caliciviridae family.

Noroviruses (NoVs) are a leading cause of gastroenteritis worldwide and are recognized as the foremost cause of foodborne illness. Despite numerous efforts, routine cell cultures have failed to yield replicating NoV. This paper describes methods used to try to grow NoV in vitro in two laboratories. Cells (A549, AGS, Caco-2, CCD-18, CRFK, CR-PEC, Detroit 551, Detroit 562, FRhK-4, HCT-8, HeLa, HEC, HEp-2, Ht-29, HuTu-80, I-407, IEC-6, IEC-18, Kato-3, L20B, MA104, MDBK, MDCK, RD, TMK, Vero and 293) were cultured on solid or permeable surfaces. Differentiation was induced using cell culture supplements such as insulin, DMSO and butyric acid. In some cases, the cells and the NoV-containing stool samples were treated with bioactive digestive additives. Variables evaluated in cultivation experiments included the method of preparation of the virus inoculum, the genotype of the virus, conditions for maintenance of cell monolayers, additives in the maintenance medium and the method of inoculation of the cells. Serial blind passage studies were performed routinely. In addition to evaluation for CPE, evidence of virus replication was sought using immunofluorescent assays to detect newly produced viral capsid antigen and RT-PCR assays to detect the viral genome. Although some infected cultures remained NoV positive by RT-PCR for up to five passages and an occasional cell in a monolayer showed evidence of specific immunofluorescence, no reproducible NoV-induced CPE was observed and all RT-PCR results that were positive initially were negative following continued passaging. Thus, attempts to develop a method for the cultivation of NoV were unsuccessful.

Major epidemic outbreaks of acute gastroenteritis result from infections with Norwalk or Norwalk-like viruses. Virus purified from stool specimens of volunteers experimentally infected with Norwalk virus was used to construct recombinant complementary DNA (cDNA) and derive clones representing most of the viral genome. The specificity of the clones was shown by their hybridization with post- (but not pre-) infection stool samples from volunteers infected with Norwalk virus and with purified Norwalk virus. A correlation was observed between the appearance of hybridization signals in stool samples and clinical symptoms of acute gastroenteritis in volunteers. Hybridization assays between overlapping clones, restriction enzyme analyses, and partial nucleotide sequence information of the clones indicated that Norwalk virus contains a single-stranded RNA genome of positive sense, with a polyadenylated tail at the 3′ end and a size of at least 7.5 kilobases. A consensus amino acid sequence motif typical of viral RNA-dependent RNA polymerases was identified in one of the Norwalk virus clones. The availability of Norwalk-specific cDNA and the new sequence information of the viral genome should permit the development of sensitive diagnostic assays and studies of the molecular biology of the virus.