Abstract In this work, we sequenced and annotated the genome of Streptochaeta angustifolia , one of two genera in the grass subfamily Anomochlooideae, a lineage sister to all other grasses. The final assembly size is over 99% of the estimated genome size, capturing most of the gene space. Streptochaeta is similar to other grasses in the structure of its fruit (a caryopsis or grain) but has peculiar flowers and inflorescences that are distinct from those in the outgroups and in other grasses. To provide tools for investigations of floral structure, we analyzed two large families of transcription factors, AP2-like and R2R3 MYBs, that are known to control floral and spikelet development in rice and maize among other grasses. Many of these are also regulated by small RNAs. Structure of the gene trees showed that the well documented whole genome duplication at the origin of the grasses (ρ) occurred before the divergence of the Anomochlooideae lineage from the lineage leading to the rest of the grasses (the spikelet clade) and thus that the common ancestor of all grasses probably had two copies of the developmental genes. However, Streptochaeta (and by inference other members of Anomochlooideae) has lost one copy of many genes. The peculiar floral morphology of Streptochaeta may thus have derived from an ancestral plant that was morphologically similar to the spikelet-bearing grasses. We further identify 114 loci producing microRNAs and 89 loci generating phased, secondary siRNAs, classes of small RNAs known to be influential in transcriptional and post-transcriptional regulation of several plant functions.

Cereal shattering and threshability, both involving disarticulation of grains from the mother plant, are important traits for cereal domestication and improvement. Recent studies highlighted diverse mechanisms influencing shattering and threshability, either through development of the disarticulation zone or floral structures enclosing or supporting the disarticulation unit. Differential lignification in the disarticulation zone is essential for rice shattering but not required for many other grasses. During shattering, the disarticulation zone undergoes either abscission leading to cell separation or cell breakage. Threshability can be affected by the morphology and toughness of the enclosing floral structures, and in some species, by the inherent weakness of the disarticulation zone. Fine-tuning shattering and threshability is essential for breeding wild and less domesticated cereals.

ABSTRACT Background Recent developments in hybridization chain reaction (HCR) have enabled robust simultaneous localization of multiple mRNA transcripts using fluorescence in situ hybridization (FISH). Once multiple split initiator oligonucleotide probes bind their target mRNA, HCR uses DNA base-pairing of fluorophore-labeled hairpin sets to self-assemble into large polymers, amplifying the fluorescence signal and reducing non-specific background. Few studies have applied HCR in plants, despite its demonstrated utility in whole mount animal tissues and cell culture. Our aim was to optimize this technique for sectioned plant tissues embedded with paraffin and methacrylate resins, and to test its utility in combination with immunolocalization and subsequent correlation with cell ultrastructure using scanning electron microscopy. Results Application of HCR to 10 µm paraffin sections of 17-day-old Setaria viridis (green millet) inflorescences using confocal microscopy revealed that the transcripts of the transcription factor KNOTTED 1 ( KN1 ) were localized to developing floret meristem and vascular tissue while SHATTERING 1 ( SH1 ) and MYB26 transcripts were co-localized to the breakpoint below the floral structures (the abscission zone). We also used methacrylate de-embedment with 1.5 µm and 0.5 µm sections of 3-day-old Arabidopsis thaliana seedlings to show tissue specific CHLOROPHYLL BINDING FACTOR a/b ( CAB1 ) mRNA highly expressed in photosynthetic tissues and ELONGATION FACTOR 1 ALPHA ( EF1 α ) highly expressed in meristematic tissues of the shoot apex. The housekeeping gene ACTIN7 ( ACT7 ) mRNA was more uniformly distributed with reduced signals using lattice structured-illumination microscopy. HCR using 1.5 µm methacrylate sections was followed by backscattered imaging and scanning electron microscopy thus demonstrating the feasibility of correlating fluorescent localization with ultrastructure. Conclusion HCR was successfully adapted for use with both paraffin and methacrylate de-embedment on diverse plant tissues in two model organisms, allowing for concurrent cellular and subcellular localization of multiple mRNAs, antibodies and other affinity probe classes. The mild hybridization conditions used in HCR made it highly amenable to observe immunofluorescence in the same section. De-embedded semi-thin methacrylate sections with HCR were compatible with correlative electron microscopy approaches. Our protocol provides numerous practical tips for successful HCR and affinity probe labeling in electron microscopy-compatible, sectioned plant material.

ABSTRACT PhasiRNAs (phased, small interfering RNAs) play a crucial role in supporting male fertility in grasses. Earlier work in maize ( Zea mays ) and rice ( Oryza sativa ) – and subsequently many other plant species – identified premeiotic 21-nt and meiotic 24-nt phasiRNAs. More recently, a group of premeiotic 24-nt phasiRNAs were discovered in the anthers of two Pooideae species, barley ( Hordeum vulgare ) and bread wheat ( Triticum aestivum ). The conservation of premeiotic 24-nt phasiRNAs and other classes of reproductive phasiRNAs across Pooideae species remains unclear. We conducted a comparative RNA profiling of three anther stages in six Pooideae species and one Bambusoideae species. We observed complex temporal accumulation patterns of 21-nt and 24-nt phasiRNAs in Pooideae and Bambusoideae grasses. In Bambusoideae, 21-nt phasiRNAs accumulated during meiosis, whereas 24-nt phasiRNAs were present in both premeiotic and postmeiotic stages. We identified premeiotic 24-nt phasiRNAs in all seven species examined. These phasiRNAs exhibit distinct biogenesis mechanisms and potential Argonaute effectors compared to meiotic 24-nt phasiRNAs. We show that specific Argonaute genes co-expressed with stage-specific phasiRNAs are conserved across Bambusoideae and Pooideae species. Our degradome analysis identified a set of conserved miRNA target genes across species, while 21-nt phasiRNAs targets were species-specific. Cleavage of few targets was observed for 24-nt phasiRNAs.

ABSTRACT Directional transport of auxin is critical for inflorescence and floral development in flowering plants, but the role of auxin influx carriers (AUX1 proteins) has been largely overlooked. Taking advantage of available AUX1 mutants in Setaria viridis and maize, we uncover previously unreported aspects of plant development that are affected by auxin influx, including higher order branches in the inflorescence, stigma branch number, and glume (floral bract) development, and plant fertility. However, disruption of auxin flux does not affect all parts of the plant, with little obvious effect on inflorescence meristem size, time to flowering, and anther morphology. In double mutant studies in maize, disruptions of ZmAUX1 also affect vegetative development. A GFP-tagged construct of SvAUX1 under its native promoter showed that the AUX1 protein localizes to the plasma membrane of outer tissue layers in both roots and inflorescences, and accumulates specifically in inflorescence branch meristems, consistent with the mutant phenotype and expected auxin maxima. RNA-seq analysis finds that most gene expression modules are conserved between mutant and wildtype plants, with only a few hundred genes differentially expressed in spp1 inflorescences. Using CRISPR-Cas9 technology, we disrupted SPP1 and the other four AUX1 homologs in S. viridis . SvAUX1/SPP1 has a larger effect on inflorescence development than the others, although all contribute to plant height, tiller formation, leaf, and root development. The AUX1 importers are thus not fully redundant in S. viridis . Our detailed phenotypic characterization plus a stable GFP-tagged line offer tools for future dissection of the function of auxin influx proteins. One sentence summary Mutations in a single auxin importer gene Spp1/SvAUX1 uncover broad and unexpected effects in nearly all aspects of the development of shoots, inflorescences, and flowers.

RNA structures are influenced by their physico-chemical environment. Few studies have assessed genome-wide impacts of abiotic stresses on in vivo RNA structure, however, and none have investigated tissue-specificity. We applied our Structure-seq method to assess in vivo mRNA secondary structure in Arabidopsis shoots and roots under control and salt stress conditions. Structure-seq utilizes dimethyl sulfate (DMS) for in vivo transcriptome-wide covalent modification of accessible As and Cs, i.e. those lacking base pairing and protection. Tissue type was a strong determinant of DMS reactivity, indicating tissue-specificity of RNA structuromes. Both tissues exhibited a significant inverse correlation between salt stress-induced changes in transcript reactivity and changes in transcript abundance, implicating changes in RNA structure and accessibility in transcriptome regulation. In mRNAs wherein the 5'UTR, CDS and 3'UTR concertedly increased or decreased in mean reactivity under salinity, this inverse correlation was more pronounced, suggesting that concordant structural changes across the mRNA have the greatest impact on abundance. Transcripts with the greatest and least salt stress-induced changes in DMS reactivity were enriched in genes encoding stress-related functions and included housekeeping functions, respectively. We conclude that secondary structure regulates mRNA abundance, thereby contributing to tissue specificity of the transcriptome and its dynamic adjustment under stress.

We present a platinum-quality genome assembly for the model grass Setaria viridis, and high quality genomic sequences of 600+ wild accessions (average 42.6x coverage). Presence-absence variation (PAV) and single-nucleotide polymorphisms (SNPs) identify several subpopulations in North America. Using genome-wide association mapping plus CRISPR-Cas9 technology, we identified and validated Less Shattering1 (SvLES1), a gene for seed shattering with a retrotransposon insertion in the domesticated S. italica (foxtail millet) allele. We also identified a candidate gene for erect leaves, orthologous to the maize gene liguleless2. These results demonstrate the utility of the model plant S. viridis for complex trait dissection in panicoid crops.