RNA levels in a cell are determined by the relative rates of RNA synthesis and decay. State-of-the-art transcriptional analyses only employ total cellular RNA. Therefore, changes in RNA levels cannot be attributed to RNA synthesis or decay, and temporal resolution is poor. Recently, it was reported that newly transcribed RNA can be biosynthetically labeled for 1-2 h using thiolated nucleosides, purified from total cellular RNA and subjected to microarray analysis. However, in order to study signaling events at molecular level, analysis of changes occurring within minutes is required. We developed an improved approach to separate total cellular RNA into newly transcribed and preexisting RNA following 10-15 min of metabolic labeling. Employing new computational tools for array normalization and half-life determination we simultaneously study short-term RNA synthesis and decay as well as their impact on cellular transcript levels. As an example we studied the response of fibroblasts to type I and II interferons (IFN). Analysis of RNA transcribed within 15-30 min at different times during the first three hours of interferon-receptor activation resulted in a >10-fold increase in microarray sensitivity and provided a comprehensive profile of the kinetics of IFN-mediated changes in gene expression. We identify a previously undisclosed highly connected network of short-lived transcripts selectively down-regulated by IFNgamma in between 30 and 60 min after IFN treatment showing strong associations with cell cycle and apoptosis, indicating novel mechanisms by which IFNgamma affects these pathways.

Coronaviruses (CoVs) are important human and animal pathogens that induce fatal respiratory, gastrointestinal and neurological disease. The outbreak of the severe acute respiratory syndrome (SARS) in 2002/2003 has demonstrated human vulnerability to (Coronavirus) CoV epidemics. Neither vaccines nor therapeutics are available against human and animal CoVs. Knowledge of host cell proteins that take part in pivotal virus-host interactions could define broad-spectrum antiviral targets. In this study, we used a systems biology approach employing a genome-wide yeast-two hybrid interaction screen to identify immunopilins (PPIA, PPIB, PPIH, PPIG, FKBP1A, FKBP1B) as interaction partners of the CoV non-structural protein 1 (Nsp1). These molecules modulate the Calcineurin/NFAT pathway that plays an important role in immune cell activation. Overexpression of NSP1 and infection with live SARS-CoV strongly increased signalling through the Calcineurin/NFAT pathway and enhanced the induction of interleukin 2, compatible with late-stage immunopathogenicity and long-term cytokine dysregulation as observed in severe SARS cases. Conversely, inhibition of cyclophilins by cyclosporine A (CspA) blocked the replication of CoVs of all genera, including SARS-CoV, human CoV-229E and -NL-63, feline CoV, as well as avian infectious bronchitis virus. Non-immunosuppressive derivatives of CspA might serve as broad-range CoV inhibitors applicable against emerging CoVs as well as ubiquitous pathogens of humans and livestock.

Positive transcription elongation factor b (P-TEFb) is the crucial player in RNA polymerase II (Pol II) pause release that has emerged as a promising target in cancer. Because single-agent therapy may fail to deliver durable clinical response, targeting of P-TEFb shall benefit when deployed as a combination therapy. We screened a comprehensive oncology library and identified clinically relevant antimetabolites and Mouse double minute 2 homolog (MDM2) inhibitors as top compounds eliciting p53-dependent death of colorectal cancer cells in synergy with selective inhibitors of P-TEFb. While the targeting of P-TEFb augments apoptosis by anti-metabolite 5-fluorouracil, it switches the fate of cancer cells by the non-genotoxic MDM2 inhibitor Nutlin-3a from cell-cycle arrest to apoptosis. Mechanistically, the fate switching is enabled by the induction of p53-dependent pro-apoptotic genes and repression of P-TEFb-dependent pro-survival genes of the PI3K-AKT signaling cascade, which stimulates caspase 9 and intrinsic apoptosis pathway in BAX/BAK-dependent manner. Finally, combination treatments trigger apoptosis of cancer cell spheroids. Together, co-targeting of P-TEFb and suppressors of intrinsic apoptosis could become a viable strategy to eliminate cancer cells.

Abstract Eukaryotic gene expression is extensively regulated by cellular stress and pathogen infections. We have previously shown that herpes simplex virus 1 (HSV-1) and several cellular stresses cause widespread disruption of transcription termination (DoTT) of RNA polymerase II (RNAPII) in host genes and that the viral immediate early factor ICP27 plays an important role in HSV-1-induced DoTT. Here, we show that HSV-1 infection also leads to widespread changes in alternative polyadenylation (APA) of host mRNAs. In the majority of cases, polyadenylation shifts to upstream poly(A) sites (PAS), including many intronic PAS. Mechanistically, ICP27 contributes to HSV-1-mediated APA regulation. HSV-1- and ICP27-induced activation of intronic PAS is sequence-dependent and does not involve general inhibition of U1 snRNP. HSV1-induced intronic polyadenylation is accompanied by early termination of RNAPII. Finally, HSV-1-induced mRNAs polyadenylated at intronic PAS are exported into the cytoplasm while APA isoforms with extended 3’ UTRs are sequestered in the nuclei, both preventing the expression of the full-length gene products. Together with other recent studies, our results suggest that viral infection and cellular stresses induce a multi-faceted host shutoff response that includes DoTT and changes in APA profiles.

ABSTRACT Positive transcription elongation factor b (P-TEFb) is the crucial player in RNA polymerase II (Pol II) pause release that has emerged as a promising target in cancer. Because single-agent therapy may fail to deliver durable clinical response, targeting of P-TEFb shall benefit when deployed as a combination therapy. We screened a comprehensive oncology library and identified clinically relevant antimetabolites and Mouse double minute 2 homolog (MDM2) inhibitors as top compounds eliciting p53-dependent death of colorectal cancer cells in synergy with selective inhibitors of P-TEFb. While the targeting of P-TEFb augments apoptosis by antimetabolite 5-fluorouracil, it switches the fate of cancer cells by the non-genotoxic MDM2 inhibitor Nutlin-3a from cell-cycle arrest to apoptosis. Mechanistically, the fate switching is enabled by the induction of p53-dependent pro-apoptotic genes and repression of P-TEFb-dependent pro-survival genes of the PI3K-AKT signaling cascade, which stimulates Caspase 9 and intrinsic apoptosis pathway in BAX/BAK-dependent manner. Finally, combination treatments trigger apoptosis of cancer cell spheroids. Together, co-targeting of P-TEFb and suppressors of intrinsic apoptosis could become a viable strategy to eliminate cancer cells.

ABSTRACT Cap0-mRNA is characterized by a 5’-5’triphosphate-linked N7-methylated guanosine(m7G). In higher eukaryotes, the methyltransferase CMTR1 additionally methylates the 2’O-position of the penultimate mRNA nucleotide(N1) ribose (cap1-mRNA). While the m7G cap is essential for mRNA export and translation initiation by the eIF4F complex, the N1-2’O-methylation prevents recognition of cap1-mRNA by the antiviral RNA receptors RIG-I and IFIT1, but a function beyond immunotolerance remained elusive. Here, we generated CMTR1 -knockout( CMTR1 -/- ) cells and found that type-I-interferon(IFN-I) treatment resulted in IFIT1-mediated reduction of cell viability and broad mRNA translation. Consequently, stimulation of the antiviral receptor RIG-I in CMTR1 -/- cells revealed an IFIT1 dependent dramatic reduction of IFN-I and chemokine protein induction, demonstrating the importance of N1-2’O-methylation for antiviral responses. Additionally, IFN-I- and IFIT1-independent effects were observed: CMTR1 -/- cells were smaller, divided slower, and exhibited a reduced transcription of mRNAs coding ribosomal proteins (RP), 5’TOP-RNA and snoRNA host genes(SNHG). Additionally, proteome and transcriptome analysis revealed that expression of NVL2, an essential factor in ribosome biogenesis, is strongly suppressed by an alternative-splicing event of NVL2 mRNA in CMTR1 -/- cells. This reduction could only be rescued by catalytically active CMTR1. Altogether, besides antiviral immunity N1-2’O-methylation by CMTR1 has broad effects on cellular physiology and controls splicing of NVL2.

Abstract The genomes of both human cytomegalovirus (HCMV) and murine cytomegalovirus (MCMV) were first sequenced over 20 years ago. Similar to HCMV, the MCMV genome had initially been proposed to harbor ≈170 open reading frames (ORFs). More recently, omics approaches revealed HCMV gene expression to be substantially more complex comprising several hundreds of translated ORFs. Here, we provide a state-of-the art reannotation of lytic MCMV gene expression based on integrative analysis of a large set of omics data. Our data reveal 363 viral transcription start sites (TiSS) that give rise to 380 and 454 viral transcripts and ORFs, respectively. The latter include >200 small ORFs, some of which represented the most highly expressed viral gene products. By combining TiSS profiling with metabolic RNA labelling and chemical nucleotide conversion sequencing (dSLAM-seq), we provide a detailed picture of the expression kinetics of viral transcription. This not only resulted in the identification of a novel MCMV immediate early transcript encoding the m166.5 ORF, which we termed ie4 , but also revealed a group of well-expressed viral transcripts that are induced later than canonical true late genes and contain an initiator element (Inr) but no TATA- or TATT-box in their core promoters. We show that viral uORFs tune gene expression of longer viral ORFs expressed in cis at translational level. Finally, we identify a truncated isoform of the viral NK-cell immune evasin m145 arising from a viral TiSS downstream of the canonical m145 mRNA. Despite being ≈5-fold more abundantly expressed than the canonical m145 protein it was not required for downregulating the NK cell ligand, MULT-I. In summary, our work will pave the way for future mechanistic studies on previously unknown cytomegalovirus gene products in an important virus animal model. Author summary We conducted a comprehensive characterization and reannotation of murine cytomegalovirus (MCMV) gene expression during lytic infection in murine fibroblasts using an integrative multi-omics approach. This unveiled hundreds of novel transcripts that explained the expression of close to 300 so far unknown viral open reading frames (ORFs). Interestingly, small viral ORFs (sORFs) were amongst the most highly expressed viral gene products and thus presumably encode for important viral microproteins of unknown function. However, we also show that sORFs located upstream of larger ORFs tune the expression of the downstream ORFs at the level of translation. We classified viral transcription start sites (TiSS) based on their expression kinetics obtained by a new combination of metabolic RNA labelling with transcription start sites profiling. This not only identified a so far unknown viral immediate-early transcript ( ie4 , m166.5 RNA) but also revealed a novel class of viral late transcripts that are expressed later than canonical true late genes and lack TATA box-like motifs. We exemplify for the m145 locus how so far unknown TiSS give rise to abundantly expressed truncated viral proteins. In summary, we provide a state-of-the-art annotation of an important model virus, which will be instrumental for future studies on CMV biology, immunology and pathogenesis.

Abstract Herpes simplex virus 1 (HSV-1) installs a profound host shut-off during lytic infection. The virion host shut-off ( vhs ) protein plays a key role in this process by efficiently cleaving both host and viral mRNAs in a translation-initiation-dependent manner. Furthermore, the onset of viral DNA replication is accompanied by a rapid decline in transcriptional activity of the host genome. Both mechanisms have tremendous impact on the RNA expression profile of the infected cells. To dissect their relative contributions and elucidate gene-specific host transcriptional responses throughout the first 8h of lytic HSV-1 infection, we here employed RNA-seq of total, newly transcribed (4sU-labelled) and chromatin-associated RNA in wild-type (WT) and Δ vhs infection of primary human fibroblasts. Following virus entry, v hs activity rapidly plateaued at an elimination rate of around 30% of cellular mRNAs per hour until 8h p.i. In parallel, host transcriptional activity dropped down to 10-20%. While the combined effects of both phenomena dominated infection-induced changes in total RNA, extensive gene-specific transcriptional regulation was observable in chromatin-associated RNA. This was surprisingly concordant between WT HSV-1 and its Δ vhs mutant and at least in parts mediated by the embryonic transcription factor DUX4. Furthermore, both WT and Δ vhs infection induced strong transcriptional up-regulation of a small subset of genes. Most of these were either poorly or not at all expressed prior to infection but already primed by H3K4me3 histone marks at their promoters. Most interestingly, analysis of chromatin-associated RNA revealed vhs -nuclease-activity-dependent transcriptional down-regulation of at least 150 cellular genes, in particular of many genes encoding integrin adhesome and extracellular matrix components. This was accompanied by a vhs -dependent reduction in protein levels by 8h p.i. for many of these genes. In summary, our study provides a comprehensive picture of the molecular mechanisms that govern cellular RNA metabolism during the first 8h of lytic HSV-1 infection. Author Summary The HSV-1 virion host shut-off ( vhs ) protein efficiently cleaves both host and viral mRNAs in a translation-dependent manner. In this study, we model and quantify changes in vhs activity as well as the virus-induced global loss of host transcriptional activity during productive HSV-1 infection. In general, HSV-1-induced alterations in total RNA levels were found to be predominantly shaped by these two global processes rather than gene-specific regulation. In contrast, chromatin-associated RNA depicted gene-specific transcriptional changes. This revealed highly concordant transcriptional changes in WT and Δvhs infection, confirmed DUX4 as a key transcriptional regulator in HSV-1 infection and depicted vhs -dependent, transcriptional down-regulation of the integrin adhesome and extracellular matrix. The latter explained some of the gene-specific effects previously attributed to vhs -mediated mRNA degradation and resulted in a concordant loss in protein levels by 8h p.i. for many of the respective genes.

Abstract Induction of type I interferon (IFN) gene expression is among the first lines of cellular defence a virus encounters during primary infection. We previously identified the tegument protein M35 of murine cytomegalovirus (MCMV) as an essential antagonist of this antiviral system. M35 localizes to the nucleus and interferes with type I IFN induction downstream of pattern-recognition receptor (PRR) activation. Here, we report structural and mechanistic details of M35’s function. Using electrophoretic mobility shift assays (EMSA), we demonstrate that purified M35 protein specifically binds to the regulatory DNA element that governs transcription of the first type I IFN gene induced in non-immune cells, Ifnb1 . Determination of M35’s crystal structure combined with reverse genetics revealed that homodimerisation is a key feature for M35’s immunomodulatory activity. DNA-binding sites of M35 overlapped with the recognition elements of interferon regulatory factor 3 (IRF3), a key transcription factor activated by PRR signalling. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) showed reduced binding of IRF3 to the host Ifnb1 promoter in the presence of M35. We furthermore defined the IRF3-dependent and the type I IFN signalling-responsive genes in murine fibroblasts by RNA sequencing of metabolically labelled transcripts (SLAM-seq), and assessed M35’s global effect on gene expression. Stable expression of M35 broadly influenced the transcriptome in untreated cells and specifically down-regulated basal expression of IRF3-dependent genes, and during MCMV infection, M35 impaired expression of IRF3-responsive genes aside of Ifnb1 . Our results suggest that M35-DNA binding directly antagonises gene induction by IRF3 and impairs the antiviral response more broadly than formerly recognised. Importance Replication of the ubiquitous human cytomegalovirus (CMV) in healthy individuals mostly goes unnoticed, but can impair foetal development or cause life-threatening symptoms in immunosuppressed or -deficient patients. Like other herpesviruses, CMV extensively manipulates its hosts and establishes lifelong latent infections. Murine CMV (MCMV) presents an important model system as it allows the study of CMV infection in the host organism. We previously showed that during entry, MCMV virions release the evolutionary conserved protein M35 protein to immediately dampen the antiviral type I interferon (IFN) response induced by pathogen detection. Here we show that M35 dimers bind to regulatory DNA elements and interfere with recruitment of interferon regulatory factor 3 (IRF3), a key factor for antiviral gene expression. Thereby, M35 interferes with expression of type I IFNs and other IRF3-dependent genes. Unrelated proteins from other herpesviruses employ the same mechanism, reflecting the importance for herpesviruses to avoid IRF3-mediated gene induction.