Abstract How genome instability is harnessed for fitness gain despite its potential deleterious effects is largely elusive. An ideal system to address this important open question is provided by the protozoan pathogen Leishmania , which exploits frequent variations in chromosome and gene copy number to regulate expression levels. Using ecological genomics and experimental evolution approaches we provide first evidence that Leishmania adaptation relies on epistatic interactions between functionally associated gene copy number variations in pathways driving fitness gain in a given environment. We further uncover post-transcriptional regulation as a key mechanism that compensates for deleterious gene dosage effects and provides phenotypic robustness to genetically heterogenous parasite populations. Finally, we correlate dynamic variations in snoRNA gene dosage with changes in rRNA 2’- O -methylation and pseudouridylation, suggesting translational control is an additional layer of parasite adaptation. Leishmania genome instability is thus harnessed for fitness gain by genome-dependent variations in gene expression, and genome-independent, compensatory mechanisms. This allows for polyclonal adaptation and maintenance of genetic heterogeneity despite strong selective pressure. The epistatic adaptation described here needs to be considered in Leishmania epidemiology and biomarker discovery, and may be relevant to other fast evolving, eukaryotic cells that exploit genome instability for adaptation, such as fungal pathogens or cancer. One Sentence Summary Epistatic interactions harness genome instability for Leishmania fitness gain.

Abstract The protozoan parasite Leishmania donovani causes fatal human visceral leishmaniasis in absence of treatment. Genome instability has been recognized as a driver in Leishmania fitness gain in response to environmental change or chemotherapy. How genome instability generates beneficial phenotypes despite potential deleterious gene dosage effects is unknown. Here we address this important open question applying experimental evolution and integrative systems approaches on parasites adapting to in vitro culture. Phenotypic analyses of parasites from early and late stages of culture adaptation revealed an important fitness tradeoff, with selection for accelerated growth in promastigote culture (fitness gain) impairing infectivity (fitness costs). Comparative genomics, transcriptomics and proteomics analyses revealed a complex regulatory network driving parasite fitness, with genome instability causing highly reproducible, gene dosage-dependent changes in protein abundance linked to post-transcriptional regulation. These in turn were associated with a gene dosage-independent reduction in abundance of flagellar transcripts and a coordinated increase in abundance of coding and non-coding RNAs implicated in ribosomal biogenesis and protein translation. We correlated differential expression of small nucleolar RNAs (snoRNAs) with changes in rRNA modification, providing first evidence that Leishmania fitness gain in culture may be controlled by post-transcriptional and epitranscriptomic regulation. Our findings propose a novel model for Leishmania fitness gain in culture, where differential regulation of mRNA stability and the generation of fitness-adapted ribosomes may potentially filter deleterious from beneficial gene dosage effects and provide proteomic robustness to genetically heterogenous, adapting parasite populations. This model challenges the current, genome-centric approach to Leishmania epidemiology and identifies the Leishmania transcriptome and non-coding small RNome as potential novel sources for the discovery of biomarkers that may be associated with parasite phenotypic adaptation in clinical settings.

Summary Pathogenic protists of the genus Leishmania have evolved various strategies to exploit macrophages as host cells and subvert their immuno-metabolic functions to favour intracellular parasite survival. Surprisingly little is known on how Leishmania affects regulated cell death (RCD) pathways of its host cell, even though increased survival of in vitro infected macrophages has been reported, and chronic macrophage infection in vivo causes the devastating immunopathologies of leishmaniasis. To overcome this limitation and gain first systems-level insight into the interaction between intracellular Leishmania and the host cell RCD pathways, including apoptosis, pyroptosis and necroptosis, we applied transcriptomic analyses on L. amazonensis -infected, primary macrophages (termed LIMs) and used YO-PRO-1 to monitor cell death by fluorescent microscopy. RNAseq analyses at day 3 post-infection (PI) revealed dichotomic dysregulation of more than 60% of RCD-related genes in LIMs, characterized by up-regulation of anti-RCD and down-regulation of pro-RCD markers, including key regulators common to the three forms of cell death such as casp8, fadd, tradd, tnfaip3, tax1bp1, birc3 , and itch . This profile correlated with expression changes of transcription factors known to regulate RCD, including AP1 and NF-κB family members, pparγ and cebpβ . Consequently, LIMs showed remarkable longevity in culture for at least 50 days, despite a constant increase of parasite burden to about 100 parasites per cell, while non-infected cells were cleared from the culture in just a few days. Longitudinal expression analysis of LIMs at days 0, 3, 15, and 30 PI by RT-qPCR confirmed stable maintenance of this high longevity profile with the dichotomic decrease and increase of RCD-activators and -inhibitors, respectively. LIMs further showed significant resistance to RCD-inducing signals compared to non-infected cells, including CSF-1 deprivation (intrinsic apoptosis), actinomycin D treatment (extrinsic apoptosis), LPS/ATP stimulation (pyroptosis). Significantly, we extended the anti-RCD expression pattern and RCD resistance phenotype to L. amazonensis -infected macrophages recovered from lesions, thus validating our long-term in vitro infection system as an easily accessible model to study chronic macrophage infection. In conclusion, our analyses firmly document the pan-anti RCD effect of L. amazonensis on its macrophage host cell in vitro and in vivo and shed important new light on mechanisms underlying Leishmania chronic infection.

ABSTRACT Macrophages are the major host cells of the protozoan parasite Leishmania in mammalian infection. These key innate immune cells display remarkable phenotypic plasticity ranging from pro-inflammatory M1 to anti-inflammatory M2 macrophages that can control infection and tissue homeostasis, respectively. It has been recognized that Leishmania exploits macrophage phenotypic plasticity to establish chronic infection. However, the current notion that these parasites simply trigger an M2-like phenotype seems over-simplified considering the immunopathology observed during leishmaniasis – in particular in response to Leishmania amazonensis - which is often characterized by a mixed Th1/Th2 immune response. Here we combined a series of systems-level analyses to shed new light on the phenotype of Leishmania -infected macrophages (LIMs) during short- and long-term infection, in vitro and in vivo . Immuno-metabolic profiling by RNA-seq, RT-qPCR, cytokine immunoassays, and real-time bioenergetic flux analysis of L. amazonensis -infected bone marrow-derived macrophages (BMDMs) revealed a highly complex and unique phenotypic and bioenergetic signature. In vitro LIMs were characterized by co-expression of both M1 and M2 markers at RNA and protein levels and increased expression of glycolytic genes that matched a progressive metabolic switch from a M2-like respiratory to a M1-like glycolytic energy production observed for both long-term in vitro and in vivo infected macrophages. Unlike in M1 macrophages, glycolytic gene expression did not correlate with increased expression of its key regulatory HIF-1α. In contrast, siRNA knock down experiments in primary BMDMs uncovered an essential role of the m 6 A reader protein IGF2BP2 in stabilizing m 6 A modified transcripts of the glycolytic pathway, contributing to HIF-1α-independent induction of glycolysis. In conclusion, L. amazonensis establishes a complex and unique phenotypic shift in infected macrophages in vitro and in vivo that combines M1-like and M2-like immuno-metabolomic characteristics and implicates differential mRNA stability in induction of aerobic glycolysis. Our data thus uncover epi-transcriptomic regulation as a novel target for Leishmania immune subversion to establish a host cell phenotype beneficial for intracellular parasite development and chronic infection.

Abstract Genome instability has been recognized as a key driver for microbial and cancer adaptation and thus plays a central role in many human pathologies. Even though genome instability encompasses different types of genomic alterations, most available genome analysis software are limited to just one kind mutation or analytical step. To overcome this limitation and better understand the role of genetic changes in enhancing pathogenicity we established GIP, a novel, powerful bioinformatic pipeline for comparative genome analysis. Here we show its application to whole genome sequencing datasets of Leishmania , Plasmodium, Candida , and cancer. Applying GIP on available data sets validated our pipeline and demonstrated the power of our analysis tool to drive biological discovery. Applied to Plasmodium vivax genomes, our pipeline allowed us to uncover the convergent amplification of erythrocyte binding proteins and to identify a nullisomic strain. Re-analyzing genomes of drug adapted Candida albicans strains revealed correlated copy number variations of functionally related genes, strongly supporting a mechanism of epistatic adaptation through interacting gene-dosage changes. Our results illustrate how GIP can be used for the identification of aneuploidy, gene copy number variations, changes in nucleic acid sequences, and chromosomal rearrangements. Altogether, GIP can shed light on the genetic bases of cell adaptation and drive disease biomarker discovery. One Sentence Summary GIP - a novel pipeline for detecting, comparing and visualizing genome instability.

ABSTRACT Leishmania ( L .) infantum is one of the main causative agents of animal and human leishmaniasis across many endemic areas in South America, Europe, North Africa, and Asia. Despite its clinical significance, little is known about the genetic diversity of L. infantum circulating in a given endemic area. Here, we investigate this important open question by applying a comparative genomics approach to seven L. infantum isolates from different hosts and Italian regions, including the northern part of the country (Emilia-Romagna, RER), Sicily, and Sardinia, as an initial attempt to explore the breadth of parasite genetic heterogeneity in Italy. Additionally, microsatellite analysis was carried out to compare the isolates from RER with other 70 L . infantum strains from the same region as well as 65 strains belonging to the L. donovani complex from other countries. We revealed important karyotypic instability and identified strain-specific changes in gene dosage, which affected important virulence factors such as amastins and surface antigen-like proteins. Single nucleotide polymorphism-based clustering analysis of these genomes together with over 80 publicly available L. infantum and L. donovani genomes placed the Italian isolates into three geographically distinct clusters within the Mediterranean basin and uncovered three isolates clustering with putative L. infantum/L. donovani hybrids isolated in Cyprus. As judged by microsatellite profiling, these hybrid isolates are representative of a sub-population of parasites circulating in northern Italy that preferentially infect humans but not dogs. Our results place Italy at the crossroads of L. infantum infection in the Mediterranean and call attention to the public health risk represented by the introduction of non-European Leishmania species. IMPORTANCE This study closes important knowledge gaps with respect to Leishmania (L.) infantum genetic heterogeneity in a given endemic country, as exemplified here for Italy, and reveals genetic hybridization as a main cause for re-emerging human leishmaniasis in northern Italy. The observed high diversity of Leishmania parasites on the Italian peninsula suggests different geographical origins, with genomic adaptation to various ecologies affecting both pathogenicity and transmission potential. This is documented by the discovery of a putative L. infantum / L. donovani hybrid strain, which has been shown to preferentially infect humans but not dogs. Our results provide important information to health authorities, which need to consider the public health risk represented by the introduction of new Leishmania species into EU countries due to population displacement or travel from countries where exotic/allochthonous parasite species are endemic.

Casein Kinase 1 (CK1) family members are serine/threonine protein kinases ubiquitously expressed in eukaryotic organisms. They are involved in a wide range of important cellular processes, such as membrane trafficking, or vesicular transport in organisms from yeast to humans. Due to its broad spectrum of action, CK1 activity and expression is tightly regulated by a number of mechanisms, including subcellular sequestration. Defects in CK1 regulation, localisation or the introduction of mutations in the CK1 coding sequence are often associated with important diseases such as cancer. Increasing evidence suggest that the manipulation of host cell CK1 signalling pathways by intracellular pathogens, either by exploiting the host CK1 or by exporting the CK1 of the pathogen into the host cell may play an important role in infectious diseases. Leishmania CK1.2 is essential for parasite survival and released into the host cell, playing an important role in host pathogen interactions. Although Leishmania CK1.2 has dual role in the parasite and in the host cell, nothing is known about its parasitic localisation and organelle-specific functions. In this study, we show that CK1.2 is a ubiquitous kinase, which is present in the cytoplasm, associated to the cytoskeleton and localised to various organelles, indicating potential roles in kinetoplast and nuclear segregation, as well as ribosomal processing and motility. Furthermore, using truncated mutants, we show for the first time that the two low complexity regions (LCR) present in the C-terminus of CK1.2 are essential for the subcellular localisation of CK1.2 but not for its kinase activity, whereas the deletion of the N-terminus leads to a dramatic decrease in CK1.2 abundance. In conclusion, our data on the localisation and regulation of Leishmania CK1.2 contribute to increase the knowledge on this essential kinase and get insights into its role in the parasite.

Leishmania spp are obligate intracellular parasites that infect vertebrate phagocytes, notably macrophages. We previously reported that Leishmania amazonensis (L. am) subvert the host cell pro-inflammatory response by dampening the macrophage NLRP3 inflammasome. No information is available on how Leishmania infection affects inflammatory cell death termed pyroptosis, known to limit microbial infection. Here, we provide first evidence that L. amazonensis-infected macrophages can undergo pyroptosis when subjected to pro-inflammatory stimuli. We analyzed the dynamics of the pyroptotic process and the fate of intracellular amastigotes at the single cell level using spinning disk confocal microscopy and high-content, real-time imaging. Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were infected with L. am amastigotes isolated from footpad lesions and sequentially treated with lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP) for canonical NLRP3 inflammasome priming and activation. Real-time monitoring was performed for 240 min post ATP addition. Longitudinal analyses revealed distinct phases of the pyroptotic process, including rapid decay of the parasitophorous vacuole (PV) as monitored by the pH-sensitive lysotracker fluid phase marker, progressive decrease in macrophage viability as monitored by accumulation of the nuclear dye YO-PRO-1, followed by translocation of the luminal PV membrane to the cell surface observed for 40% of macrophages, resulting in the extracellular exposure of amastigotes that remained anchored to the PV membrane. Scanning and transmission electron microscopy analyses revealed a highly polarized orientation of parasites with exclusive exposure of the anterior pole toward the extracellular milieu, and an attachment site forming a potential biological junction between the parasite posterior pole and the PV membrane. We showed that the exposed parasites are resistant to the cytolytic host cell activities linked to pyroptosis and retain their full infectious potential in reinfection experiments using naive macrophages. Together these data uncover a novel Leishmania immune subversion strategy that may allow stealthy parasite dissemination via the uptake of pyroptotic host debris by uninfected phagocytes.

Leishmaniases are major vector-borne tropical diseases responsible for great human morbidity and mortality, caused by protozoan, trypanosomatid parasites of the genus Leishmania. In the mammalian host parasites survive and multiply within mononuclear phagocytes, especially macrophages. However, the underlying mechanisms by which Leishmania spp affect their host, are not fully understood. Herein, proteomic alterations of primary bone marrow-derived, BALB/c macrophages are documented after 72 h of infection with Leishmania donovani insect-stage promastigotes, with the use of a SILAC-based, quantitative proteomics approach. The protocol was optimised by combining strong anion exchange and gel electrophoresis fractionation that displayed similar depth of analysis (>5500 proteins). Our analyses revealed 86 differentially modulated proteins (35 showing increased and 51 decreased abundance) in response to Leishmania donovani infection. The proteomics results were validated by analysing the abundance of selected proteins. Intracellular Leishmania donovani infection led to changes in various host cell biological processes, including primary metabolism and catabolic process, with a significant enrichment in lysosomal organisation. Overall, our analysis allows new technical insight into the challenges of quantitative proteomics applied on primary cells, and establishes the first proteome of bona fide primary macrophages infected ex vivo with Leishmania donovani, revealing new mechanisms acting at the host/pathogen interface.

ABSTRACT Trypanosomatid pathogens are transmitted by blood-feeding insects, causing devastating human infections. Survival of these parasites in their vertebrate and invertebrate hosts relies on their capacity to differentiate into distinct stages that are the result of a co-evolutionary process. These stages show in addition important phenotypic shifts that often impacts infection, affecting for example parasite pathogenicity, tissue tropism, or drug susceptibility. Despite their clinical relevance, the evolutionary mechanisms that allow for the selection of such adaptive phenotypes remain only poorly investigated. Here we use Leishmania donovani as a trypanosomatid model pathogen to shed first light on parasite evolutionary adaptation during experimental sand fly infection. Applying a comparative genomics approach on hamster- isolated amastigotes and derived promastigotes before (input) and after (output) infection of Phlebotomus orientalis revealed a strong bottleneck effect on the parasite population as judged by principal component and phylogenetic analyses of input and output parasite DNA sequences. Despite random genetic drift caused by the bottleneck effect, our analyses revealed various genomic signals that seem under positive selection given their convergence between independent biological replicates. While no significant fluctuations in gene copy number were revealed between input and output parasites, convergent selection was observed for karyotype, haplotype and allelic changes during sand fly infection. Our analyses further uncovered signature mutations of oxidative DNA damage in the output parasite genomes, suggesting that Leishmania suffers from oxidative stress inside the insect digestive tract. Our results propose a new model of Leishmania genomic adaptation during sand fly infection, where oxidative DNA damage and DNA repair processes drive haplotype and allelic selection. The experimental and computational framework presented here provides a useful blueprint to assess evolutionary adaptation of other eukaryotic pathogens inside their insect vectors, such as Plasmodium spp, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi .