Abstract Background We describe novel plasmid vectors for transient gene expression using Agrobacterium , infiltrated into Nicotiana benthamiana leaves. We have generated a series of pGreenII cloning vectors that are ideally suited to transient gene expression, by removing elements of conventional binary vectors necessary for stable transformation such as transformation selection genes. Results We give an example of expression of heme-thiolate P450 to demonstrate effectiveness of this system. We have also designed vectors that take advantage of a dual luciferase assay system to analyse promoter sequences or post-transcriptional regulation of gene expression. We have demonstrated their utility by co-expression of putative transcription factors and the promoter sequence of potential target genes and show how orthologous promoter sequences respond to these genes. Finally, we have constructed a vector that has allowed us to investigate design features of hairpin constructs related to their ability to initiate RNA silencing, and have used these tools to study cis -regulatory effect of intron-containing gene constructs. Conclusion In developing a series of vectors ideally suited to transient expression analysis we have provided a resource that further advances the application of this technology. These minimal vectors are ideally suited to conventional cloning methods and we have used them to demonstrate their flexibility to investigate enzyme activity, transcription regulation and post-transcriptional regulatory processes in transient assays.

Summary Anthocyanin concentration is an important determinant of the colour of many fruits. In apple ( Malus × domestica ), centuries of breeding have produced numerous varieties in which levels of anthocyanin pigment vary widely and change in response to environmental and developmental stimuli. The apple fruit cortex is usually colourless, although germplasm does exist where the cortex is highly pigmented due to the accumulation of either anthocyanins or carotenoids. From studies in a diverse array of plant species, it is apparent that anthocyanin biosynthesis is controlled at the level of transcription. Here we report the transcript levels of the anthocyanin biosynthetic genes in a red‐fleshed apple compared with a white‐fleshed cultivar. We also describe an apple MYB transcription factor, MdMYB10 , that is similar in sequence to known anthocyanin regulators in other species. We further show that this transcription factor can induce anthocyanin accumulation in both heterologous and homologous systems, generating pigmented patches in transient assays in tobacco leaves and highly pigmented apple plants following stable transformation with constitutively expressed MdMYB10. Efficient induction of anthocyanin biosynthesis in transient assays by MdMYB10 was dependent on the co‐expression of two distinct bHLH proteins from apple, MdbHLH3 and MdbHLH33. The strong correlation between the expression of MdMYB10 and apple anthocyanin levels during fruit development suggests that this transcription factor is responsible for controlling anthocyanin biosynthesis in apple fruit; in the red‐fleshed cultivar and in the skin of other varieties, there is an induction of MdMYB10 expression concurrent with colour formation during development. Characterization of MdMYB10 has implications for the development of new varieties through classical breeding or a biotechnological approach.

The International Strawberry Sequencing Consortium reports the draft genome of the woodland strawberry (Fragaria vesca). The genome of this diploid species should serve as a reference genome for the Fragaria genus, as the cultivated strawberry (Fragaria × ananassa) is an octoploid where F. vesca is predicted to be a subgenome donor. The woodland strawberry, Fragaria vesca (2n = 2x = 14), is a versatile experimental plant system. This diminutive herbaceous perennial has a small genome (240 Mb), is amenable to genetic transformation and shares substantial sequence identity with the cultivated strawberry (Fragaria × ananassa) and other economically important rosaceous plants. Here we report the draft F. vesca genome, which was sequenced to ×39 coverage using second-generation technology, assembled de novo and then anchored to the genetic linkage map into seven pseudochromosomes. This diploid strawberry sequence lacks the large genome duplications seen in other rosids. Gene prediction modeling identified 34,809 genes, with most being supported by transcriptome mapping. Genes critical to valuable horticultural traits including flavor, nutritional value and flowering time were identified. Macrosyntenic relationships between Fragaria and Prunus predict a hypothetical ancestral Rosaceae genome that had nine chromosomes. New phylogenetic analysis of 154 protein-coding genes suggests that assignment of Populus to Malvidae, rather than Fabidae, is warranted.

Abstract Background The control of plant anthocyanin accumulation is via transcriptional regulation of the genes encoding the biosynthetic enzymes. A key activator appears to be an R2R3 MYB transcription factor. In apple fruit, skin anthocyanin levels are controlled by a gene called MYBA or MYB1 , while the gene determining fruit flesh and foliage anthocyanin has been termed MYB10 . In order to further understand tissue-specific anthocyanin regulation we have isolated orthologous MYB genes from all the commercially important rosaceous species. Results We use gene specific primers to show that the three MYB activators of apple anthocyanin ( MYB10/MYB1/MYBA) are likely alleles of each other. MYB transcription factors, with high sequence identity to the apple gene were isolated from across the rosaceous family (e.g. apples, pears, plums, cherries, peaches, raspberries, rose, strawberry). Key identifying amino acid residues were found in both the DNA-binding and C-terminal domains of these MYBs. The expression of these MYB10 genes correlates with fruit and flower anthocyanin levels. Their function was tested in tobacco and strawberry. In tobacco, these MYBs were shown to induce the anthocyanin pathway when co-expressed with bHLHs, while over-expression of strawberry and apple genes in the crop of origin elevates anthocyanins. Conclusions This family-wide study of rosaceous R2R3 MYBs provides insight into the evolution of this plant trait. It has implications for the development of new coloured fruit and flowers, as well as aiding the understanding of temporal-spatial colour change.

Reactive oxygen species (ROS) play a prominent role in early and later stages of the plant pathogenesis response, putatively acting as both cellular signaling molecules and direct antipathogen agents. A single-cell assay, based on the fluorescent probe dichlorofluorescein, was used to scrutinize the generation and movement of ROS in tobacco epidermal tissue. ROS, generated within cells, quickly moved apoplastically as H2O2 into neighboring cells. Two classes of rapidly elicited intracellular ROS, originating from distinct sources, were distinguished. Cryptogein, the fungal elicitor from Phytophthora cryptogea, induced ROS from a flavin-containing oxidase source. ROS accumulation could be inhibited by a number of pharmacological agents, suggesting induction through an active signal transduction pathway. The insensitivity of the increase in ROS to the external addition of enzymes that dissipate ROS suggests that this oxidative increase is primarily intracellular. In contrast, amines and polyamines, compounds that form during wounding and pathogenesis, induced ROS at an apoplastic site from peroxidase- or amine oxidase-type enzyme(s). Salicylic acid, a putative inhibitor of cellular catalases and peroxidases, did not induce cellular ROS, as measured by dichlorofluorescein fluorescence. The physiological relevance of ROS-generated signals was indicated by the rapid alteration of the epidermal cell glutathione pool and the cellular redox state. In addition, induction of ROS by all elicitors was correlated with subsequent cell death.

Mutations in the genes encoding for either the biosynthetic or transcriptional regulation of the anthocyanin pathway have been linked to color phenotypes. Generally, this is a loss of function resulting in a reduction or a change in the distribution of anthocyanin. Here, we describe a rearrangement in the upstream regulatory region of the gene encoding an apple (Malus x domestica) anthocyanin-regulating transcription factor, MYB10. We show that this modification is responsible for increasing the level of anthocyanin throughout the plant to produce a striking phenotype that includes red foliage and red fruit flesh. This rearrangement is a series of multiple repeats, forming a minisatellite-like structure that comprises five direct tandem repeats of a 23-bp sequence. This MYB10 rearrangement is present in all the red foliage apple varieties and species tested but in none of the white fleshed varieties. Transient assays demonstrated that the 23-bp sequence motif is a target of the MYB10 protein itself, and the number of repeat units correlates with an increase in transactivation by MYB10 protein. We show that the repeat motif is capable of binding MYB10 protein in electrophoretic mobility shift assays. Taken together, these results indicate that an allelic rearrangement in the promoter of MYB10 has generated an autoregulatory locus, and this autoregulation is sufficient to account for the increase in MYB10 transcript levels and subsequent ectopic accumulation of anthocyanins throughout the plant.

Summary Anthocyanin pigmentation is an important consumer trait in peach ( Prunus persica ). In this study, the genetic basis of the blood‐flesh trait was investigated using the cultivar Dahongpao, which shows high levels of cyanidin‐3‐glucoside in the mesocarp. Elevation of anthocyanin levels in the flesh was correlated with the expression of an R2R3 MYB transcription factor, Pp MYB 10.1 . However, Pp MYB 10.1 did not co‐segregate with the blood‐flesh trait. The blood‐flesh trait was mapped to a 200‐kb interval on peach linkage group ( LG ) 5. Within this interval, a gene encoding a NAC domain transcription factor ( TF ) was found to be highly up‐regulated in blood‐fleshed peaches when compared with non‐red‐fleshed peaches. This NAC TF , designated BLOOD ( BL ), acts as a heterodimer with Pp NAC 1 which shows high levels of expression in fruit at late developmental stages. We show that the heterodimer of BL and Pp NAC 1 can activate the transcription of Pp MYB 10.1 , resulting in anthocyanin pigmentation in tobacco. Furthermore, silencing the BL gene reduces anthocyanin pigmentation in blood‐fleshed peaches. The transactivation activity of the BL ‐Pp NAC 1 heterodimer is repressed by a SQUAMOSA promoter‐binding protein‐like TF , Pp SPL 1. Low levels of Pp MYB 10.1 expression in fruit at early developmental stages is probably attributable to lower levels of expression of Pp NAC 1 plus the presence of high levels of repressors such as Pp SPL 1. We present a mechanism whereby BL is the key gene for the blood‐flesh trait in peach via its activation of Pp MYB 10.1 in maturing fruit. Partner TF s such as basic helix–loop‐helix proteins and NAC 1 are required, as is the removal of transcriptional repressors.

The biosynthesis of anthocyanin in many plants is affected by environmental conditions. In apple (Malus × domestica Borkh.), concentrations of fruit anthocyanins are lower under hot climatic conditions. We examined the anthocyanin accumulation in the peel of maturing 'Mondial Gala' and 'Royal Gala' apples, grown in both temperate and hot climates, and using artificial heating of on-tree fruit. Heat caused a dramatic reduction of both peel anthocyanin concentration and transcripts of the genes of the anthocyanin biosynthetic pathway. Heating fruit rapidly reduced expression of the R2R3 MYB transcription factor (MYB10) responsible for coordinative regulation for red skin colour, as well as expression of other genes in the transcriptional activation complex. A single night of low temperatures is sufficient to elicit a large increase in transcription of MYB10 and consequently the biosynthetic pathway. Candidate genes that can repress anthocyanin biosynthesis did not appear to be responsible for reductions in anthocyanin content. We propose that temperature-induced regulation of anthocyanin biosynthesis is primarily caused by altered transcript levels of the activating anthocyanin regulatory complex.

Summary Red fruits are popular and widely accepted by consumers because of an enhanced appearance and enriched anthocyanins. The molecular mechanism of anthocyanin regulation in red‐skinned pear ( Pyrus ) has been studied, and the genes encoding the biosynthetic steps and several transcription factors ( TF s) have been characterized. In this study, a candidate R2R3 MYB TF , Py MYB 114 , was identified by linkage to the quantitative trait loci ( QTL ) for red skin color on linkage group 5 in a population of Chinese pear ( Pyrus bretschneideri ). The function of Py MYB 114 was verified by transient transformation in tobacco ( Nicotinana tabacum ) leaves and strawberry ( Fragaria ) and pear fruits, resulting in the biosynthesis of anthocyanin. Suppression of Py MYB 114 could inhibit anthocyanin biosynthesis in red‐skinned pears. The ERF / AP 2 TF Py ERF 3 was found to interact with Py MYB 114 and its partner Pyb HLH 3 to co‐regulate anthocyanin biosynthesis, as shown by a dual luciferase reporter system and a yeast two‐hybrid assay. In addition, the transcript abundance of Py MYB 114 and Py MYB 10 were correlated, and co‐transformation of these two genes into tobacco and strawberry led to enhanced anthocyanin biosynthesis. This interaction network provides insight into the coloration of fruits and the interaction of different TF s to regulate anthocyanin biosynthesis.