Abstract Vascular pathogens travel long distances through host veins leading to life-threatening, systemic infections. In contrast, non-vascular pathogens remain restricted to infection sites, triggering localized symptom development. The contrasting features of vascular and non-vascular diseases suggest distinct etiologies, but the basis for each remains unclear. Here, we show that the hydrolase CbsA acts as a phenotypic switch between vascular and non-vascular plant pathogenesis. cbsA was enriched in genomes of vascular phytopathogenic bacteria in the Xanthomonadaceae family and absent in most non-vascular species. CbsA expression allowed non-vascular Xanthomonas to cause vascular blight while cbsA mutagenesis resulted in reduction of vascular or enhanced non-vascular symptom development. Phylogenetic hypothesis testing further revealed that cbsA was lost in multiple non-vascular lineages and more recently gained by some vascular subgroups, suggesting that vascular pathogenesis is ancestral. Our results overall demonstrate how the gain and loss of single loci can facilitate the evolution of complex ecological traits.

Complete panicle exsertion (CPE) is an economically important quantitative trait that contributes to grain yield in rice. We deployed an integrated approach for understanding the molecular mechanism of CPE using a stable EMS mutant line, CPE-109 of Samba Mahsuri (SM) exhibiting CPE. Two consistent genomic regions have been identified for CPE through QTL mapping [qCPE-4 (28.24-31.22 Mb) and qCPE-12 (2.30-3.18 Mb)] and QTL-sequencing [Chr-4 (31.21-33.69 Mb) and Chr-12 (0.12-3.15 Mb)]. Two non-synonymous SNPs, viz; KASP 12-12 (T→C; Chr12:1269983) in Os12g0126300; AP2/ERF transcription factor and KASP 12-16 (G→A; Chr12:1515198) in Os12g0131400; F-box domain-containing protein explained 81.05 and 59.61% phenotypic variance respectively and exhibited strong co-segregation with CPE in F2 mapping populations, advanced generation lines and CPE exhibiting SM mutants through KASP assays. The downregulation of these genes in CPE-109 compared to SM was observed in transcriptome sequencing of flag leaves which was validated through qRT-PCR. We propose that the abrogation of Os12g0126300 and Os12g0131400 in CPE-109 combinatorially influences the downregulation of ethylene biosynthetic genes viz. ACC synthase, ethylene-responsive factor-2, and up-regulation of gibberellic acid synthetic genes viz. ent-kaurene synthase and two cytokinin biosynthesis genes viz. cytokinin-O-glucosyltransferase 2, carboxy-lyase which result in complete panicle exsertion.

Abstract Many plant-associated bacteria produce plant- mimicking hormones which are involved in modulating host physiology. However, their function in modulating bacterial physiology has not been reported. Here we show that the XopQ protein, a type-III effector of the rice pathogen, Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( Xoo ), is involved in cytokinin biosynthesis. Xoo produces and secretes an active form of cytokinin which enables the bacterium to maintain a planktonic lifestyle and promotes virulence. RNA-seq analysis indicates that the cytokinin produced by Xoo is required for the regulation of several genes which are involved in biofilm formation. We have also identified the Xoo isopentenyl transferase gene, which is involved in the cytokinin biosynthesis pathway and is required for maintaining planktonic behaviour and virulence. Furthermore, mutations in the predicted cytokinin receptor kinase (PcrK) and the downstream response regulator (PcrR) of Xoo phenocopy the cytokinin biosynthetic mutants, but are not complemented by supplementation with exogenous cytokinin. Cytokinin biosynthetic functions are encoded in a number of diverse bacterial genomes suggesting that cytokinin may be a widespread signalling molecule in the bacterial kingdom.

The genus Luteibacter, a member of the family Rhodanobacteraceae, encompasses Gram-negative bacteria found in diverse environments. In the present study, four yellow-pigmented bacterial isolates designated as PPL193T, PPL201, PPL552, and PPL554 were obtained and identified as Gram-negative, rod-shaped, and motile bacteria. Biochemical characterization and examination of the 16S rRNA gene sequence, derived from the genomic sequence, identified it as belonging to the genus Luteibacter. The isolates are closely related to Luteibacter yeojuensis R2A16-10T, forming a distinct monophyletic lineage with L. aegosomatis KCTC 92392T and L. anthropi CCUG25036T. The calculated values for pairwise ortho Average Nucleotide Identity and digital DNA-DNA hybridization in comparison to previously reported Luteibacter species fell below the established thresholds for species delineation. As this novel species was isolated from rice seeds as a potential Xanthomonas due to its distinctive yellow-colored colonies, we sought to identify the presence of xanthomonadin pigment in this species. Intriguingly, our findings revealed the presence of the typical peak corresponding to xanthomonadin in the UV spectra, confirming its presence in this novel species and adaptation to plant habitat. Furthermore, the detailed genomic investigation also uncovered the genomic locus corresponding to xanthomonadin biosynthetic gene cluster, further suggesting that members of this novel species are co-habitants of plant pathogenic and plant probiotic Xanthomonas group of phytobacteria within rice seeds. Apart from protease production, the species was found to produce Indole-3-Acetic Acid (IAA) in higher quantities and was also able to protect plants from Xanthomonas oryzae pv. oryzae, a major pathogen of rice indicating its probiotic nature. Genome scanning revealed the presence of genomic region(s) encoding loci for biosynthesis of anti-microbial peptides and other metabolites with probiotic properties, further confirming its probiotic properties. This study highlights the importance of using a combination of phenotypic and genotypic methods for bacterial identification and expands our knowledge of the diversity and distribution of diverse bacteria associated with rice seeds and their microbiome. Luteibacter sahnii sp. nov. is proposed as a novel species of the genus Luteibacter with PPL193T=MTCC 13290T=ICMP 24807T=CFBP 9144T as its type strain and PPL201, PPL552, and PPL554 as other constituent members.

Xanthomonas oryzae pv. oryzae uses several type III secretion system (T3SS) effectors, namely XopN, XopQ, XopX, and XopZ, to suppress rice immune responses that are induced following treatment with cell wall degrading enzymes. Here we show that the T3SS secreted effector XopX interacts with two of the eight rice 14-3-3 proteins. Mutants of XopX that are defective in 14-3-3 binding are also defective in suppression of immune responses, suggesting that interaction with 14-3-3 proteins is required for suppression of host innate immunity. However, Agrobacterium mediated delivery of both XopX and XopQ into rice cells results in induction of rice immune responses. These immune responses are not observed when either protein is individually delivered into rice cells. XopQ-XopX induced rice immune responses are not observed in a XopX mutant that is defective in 14-3-3 binding. Yeast two- hybrid and BiFC assays indicate that XopQ and XopX interact with each other. In a screen for Xanthomonas effectors which can suppress XopQ- XopX induced rice immune responses, five effectors were identified, namely XopU, XopV, XopP, XopG and AvrBs2, which were able to do so. These results suggest a complex interplay of Xanthomonas T3SS effectors in suppression of pathogen triggered immunity and effector triggered immunity to promote virulence on rice.

Alternative splicing (AS) is a molecular mechanism governing gene expression, particularly in plants, wherein a single gene can yield multiple mRNA transcripts, thereby diversifying the resulting protein isoforms. Panicle exsertion (PE) is an important trait associated with grain yield in rice. We deployed the mRNA sequencing (transcriptome) data from incompletely exserted panicle genotype, BPT-5204 and its ethyl methanesulphonate (EMS) mutant lines viz., CPE-109 and CPE-110 exhibiting completely exserted panicle for identification of Alternative Splicing (AS) events. Our systematic analysis using rMATS package revealed 414 and 368 genes alternatively spliced upon the comparison of CPE-109 with BPT-5204 and CPE-110 with BPT-5204 respectively. We identified alternative 3′ splice site (A3SS) as the predominant AS type upon comparison of CPE-109 with BPT-5204 (51.20% A3SS) and CPE-110 with BPT-5204 (48.91% A3SS) at panicle initiation stage. In total 23 and 19 genes emanated multiple transcripts via., AS. Remarkably, upon comparison of splicing data of CPE-109 with BPT-5204 and CPE-110 with BPT-5204, we found three common genes namely, Os07g0406600 encoding DDHD domain containing protein, Os10g0442100 encoding tRNA methyltransferase and Os04g0675800 encoding H0103C06.10 protein, that generated more than two transcripts via., AS. These genes can be further validated for determining its role in panicle exsertion through gene expression studies, overexpression and functional characterization.

Two yellow pigmented bacterial strains were isolated from healthy rice seeds. The strains designated as PPL560T and PPL568 were identified as members of genus Xanthomonas based on analysis of biochemical and 16S rRNA gene sequence retrieved from whole genome sequence. Isolates formed a distinct monophyletic lineage with X. sontii and X. sacchari as the closest relatives in the phylogenetic tree based on core gene content shared by reported species in genus Xanthomonas. Pairwise ortho Average Nucleotide Identity and digital DNA-DNA hybridisation values calculated against other species of Xanthomonas were below their respective cut-offs. In planta studies revealed that PPL560T and PPL568 are non-pathogenic to rice plants upon leaf clip inoculation. Absence of type III secretion system related genes and effectors further supported their non-pathogenic status. Herein, we propose Xanthomonas indica sp. nov. as novel species of genus Xanthomonas with PPL560T=MTCC13185 as its type strain and PPL568 as another constituent member.

Abstract Xanthomonas species have been extensively studied as major and model pathogens of plants. However, there is an increasing recognition of the complex and large world of non-pathogenic species of Xanthomonas in the recent decades. One pathogenic Xanthomonas species has been known in rice for the last hundred years, yet in recent years, three non-pathogenic Xanthomonas (NPX) species have been reported. Thus, there is a need to understand the species-level diversity of NPXs like their pathogenic counterparts. In the present study, we report isolation and investigation into the genomic diversity of Xanthomonas indica , a newly discovered NPX species from rice. The study allowed us to establish the relationship of X. indica strains within clade I of Xanthomonads. All the strains formed a distinct but diverse clade compared to clades corresponding to other NPX species from rice and other hosts. X. indica lacks major virulence factors found in their pathogenic counterparts. Identification of highly diverse strains and open-pan genome indicates ongoing selection to acquire new functions for adaptation. X. indica also harbours large-scale interstrain variations in the lipopolysaccharide O-antigen biosynthetic gene cluster, which hints at the selection at this locus. Interestingly, all the diverse strains of X. indica were able to protect rice from bacterial leaf blight pathogen of rice upon leaf clip inoculation. Comparative genomics revealed the association of a RiPP, a metalloprotease and a bacterial-killing type IV secretion system conserved across its related member species, including X. sontii , in the clade I with in-vivo anti-pathogenic properties. Overall the study has provided novel evolutionary insights into an important NPX member species. The findings and genomic resources will allow further systematic molecular studies to understand its interaction with the host plant.

Abstract Bacteria respond to environmental cues in different ways. Phase variation is one such adaptation where heritable and reversible changes in DNA aid bacteria to alter the expression of specific genes. The bacterial plant pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) causes the serious bacterial blight disease of rice. The mucoid phenotype of Xoo colonies is attributed to the secreted exopolysaccharide (EPS), xanthan gum. Spontaneous non-mucoid variants of Xoo which are deficient in EPS production and virulence were observed to accumulate in long-term stationary phase cultures. This phenomenon was termed stationary phase variation and variant colonies as stationary phase variants (SPV). Several but not all of these SPVs have been earlier described to carry spontaneous insertions of endogenous insertion sequence elements in the gum operon which encodes genes involved in EPS biosynthesis. In this study, we show that a number of SPVs harbour variations in the lipopolysaccharide (LPS) outer antigen (O-antigen) biosynthetic gene cluster. The data revealed that the vast majority of variations are due to either insertion of endogenous insertion sequence (IS) elements or slipped strand mispairing (SSM). Also, it was observed that many of these SPVs exhibited reversion to wild type mucoid phenotype via restoration of the wild type genotype. The results indicate that the phenomenon of phase variation is occurring in the LPS O-antigen biosynthetic gene cluster of Xoo.

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), the causal agent of bacterial blight of rice, translocates multiple Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) into rice cells. The TALEs localize to the host cell nucleus, where they bind to the DNA in a sequence-specific manner and enhance gene expression to promote disease susceptibility. Xoo strain PXO99A encodes nineteen TALEs, but the host targets of all these TALEs have not been defined. A meta-analysis of rice transcriptome profiles revealed a gene annotated as flavonol synthase/flavanone-3 hydroxylase (henceforth OsS5H/FNS-03g) to be highly induced upon Xoo infection. Further analyses revealed that this gene is induced by PXO99A using TAL9b, a broadly conserved TALE of Xoo. Disruption of tal9b rendered PXO99A less virulent. OsS5H/FNS-03g functionally complemented its Arabidopsis homologue AtDMR6, a well-studied disease susceptibility locus. Biochemical analyses suggested that OsS5H/FNS-03g is a bifunctional protein with Salicylic Acid-5 Hydroxylase (S5H) and Flavone Synthase-I (FNS-I) activities. Further, an exogenous application of apigenin on rice leaves, the flavone that is enzymatically produced by OsS5H/FNS-03g, promoted virulence of PXO99A tal9b-. Overall, our study suggests that OsS5H/FNS-03g is a bifunctional enzyme and its product apigenin is potentially involved in promoting Xoo virulence.