Abstract Corydalis yanhusuo W.T. Wang is a classic herb that is frequently used in traditional Chinese medicine and is efficacious in promoting blood circulation, enhancing energy, and relieving pain. Benzylisoquinoline alkaloids (BIAs) are the main bioactive ingredients in Corydalis yanhusuo . However, few studies have investigated the BIA biosynthetic pathway in C. yanhusuo , and the biosynthetic pathway of species-specific chemicals such as tetrahydropalmatine remains unclear. We performed full-length transcriptomic and metabolomic analyses to identify candidate genes that might be involved in BIA biosynthesis and identified a total of 101 full-length transcripts and 19 metabolites involved in the BIA biosynthetic pathway. Moreover, the contents of 19 representative BIAs in C. yanhusuo were quantified by classical targeted metabolomic approaches. Their accumulation in the tuber was consistent with the expression patterns of identified BIA biosynthetic genes in tubers and leaves, which reinforces the validity and reliability of the analyses. Full-length genes with similar expression or enrichment patterns were identified, and a complete BIA biosynthesis pathway in C. yanhusuo was constructed according to these findings. Phylogenetic analysis revealed a total of ten enzymes that may possess columbamine-O-methyltransferase activity, which is the final step for tetrahydropalmatine synthesis. Our results span the whole BIA biosynthetic pathway in C. yanhusuo . Our full-length transcriptomic data will enable further molecular cloning of enzymes and activity validation studies.

This review summarizes the recent work of covalent chemistry in targeted protein degradation and describes the concept, pros and cons, development, and the outlook of covalent PROTACs.

The mulberry leaf is a classic herb commonly used in traditional Chinese medicine. It has also been used as animal feed for livestock and its fruits have been made into a variety of food products. Traditionally, mulberry ( Morus alba L.) leaf harvesting after frost is thought to have better medicinal properties, but the underlying mechanism remains largely unsolved. To elucidate the biological basis of mulberry leaves after frost, we first explored the content changes of various compounds in mulberry leaves at different harvest times. Significant enrichment of flavonoids was observed with a total of 224 differential metabolites after frost. Subsequently, we analyzed the transcriptomic data of mulberry leaves collected at different harvest times and successfully annotated 22,939 unigenes containing 1,695 new genes. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis revealed 26, 20, and 59 unigenes related to flavonoids synthesis in three different groups harvested at different times. We found that the expression levels of flavonoid biosynthesis-related unigenes also increased when harvested at a delayed time, which was consistent with the flavonoid accumulation discovered by the metabolomic analysis. The results indicated that low temperature may be a key trigger in flavonoid biosynthesis of mulberry leaves by increasing the expression of flavonoid biosynthesis-related genes. This study also provided a theoretical basis for the optimal harvest time of mulberry leaves.

Key word: qPCR; Corydalisyanhusuo; reference genes; geNorm; NormFinder; BestKeeper.

Building on our previous work on ibrutinib-based reversible covalent Bruton's tyrosine kinase (BTK) PROTACs, we explored a different irreversible BTK inhibitor poseltinib as the BTK binder for PROTAC development. Different from ibrutinib, converting the irreversible cysteine reacting acrylamide group of poseltinib to a reversible covalent cyano-acrylamide group dramatically decreases the binding affinity to BTK by over 700 folds. Interestingly, one of the reversible covalent BTK PROTACs based on poseltinib with a rigid linker, dubbed as PS-RC-1, is highly potent (IC50 ​= ​∼10 ​nM) in Mino cells but not in other mantle cell lymphoma (MCL) cell lines, such as Jeko-1 and Rec-R cells. We showed that PS-RC-1 potently induces degradation of IKZF1 and IKZF3 but not BTK or GSPT1, accounting for its toxicity in Mino cells. We further decreased the molecular size of PS-RC-1 by shrinking the BTK binding moiety and developed PS-2 as a potent BTK and IKZF1/3 triple degrader with high specificity.

β-lactamases inactivate β-lactam antibiotics leading to drug resistance. Consequently, inhibitors of β-lactamases can combat this resistance, and the β-lactamase inhibitory protein (BLIP) is a naturally occurring inhibitor. The widespread CTX-M-14 and CTX-M-15 β-lactamases have an 83% sequence identity. In this study, we show that BLIP weakly inhibits CTX-M-14 but potently inhibits CTX-M-15. The structure of the BLIP/CTX-M-15 complex reveals that binding is associated with a conformational change of an active site loop of β-lactamase. Surprisingly, the loop structure in the complex is similar to that in a drug-resistant variant (N106S) of CTX-M-14. We hypothesized that the pre-established favorable loop conformation of the N106S mutant would facilitate binding. The N106S substitution results in a ~100- and 10-fold increase in BLIP inhibition potency for CTX-M-14 and CTX-M-15, respectively. Thus, this indicates that an active site loop in β-lactamase toggles between conformations that control antibiotic hydrolysis and inhibitor susceptibility. These findings highlight the role of accessible active site conformations in controlling enzyme activity and inhibitor susceptibility as well as the influence of mutations in selectively stabilizing discrete conformations.

Target protein degradation (TPD) has emerged as a revolutionary approach in drug discovery, leveraging the cell's intrinsic machinery to selectively degrade disease-associated proteins. Nanoluciferase (nLuc) fusion proteins and the NanoBiT technology offer two robust and sensitive screening platforms to monitor the subtle changes in protein abundance induced by TPD molecules. Despite these advantages, concerns have arisen regarding potential degradation artifacts introduced by tagging systems due to the presence of lysine residues on them, prompting the development of alternative tools. In this study, we introduce HiBiT-RR and nLucK0, variants devoid of lysine residues, to mitigate such artifacts. Our findings demonstrate that HiBiT-RR maintains a similar sensitivity and binding affinity with the original HiBiT. Moreover, the comparison between nLucWT and nLucK0 constructs reveals variations in degradation patterns induced by certain TPD molecules, emphasizing the importance of choosing appropriate tagging systems to ensure the reliability of experimental outcomes in studying protein degradation processes.