It is challenging to derive totipotent stem cells in vitro that functionally and molecularly resemble cells from totipotent embryos. Here, we report that a chemical cocktail enables the derivation of totipotent-like stem cells, designated as totipotent potential stem (TPS) cells, from 2-cell mouse embryos and extended pluripotent stem cells, and that these TPS cells can be stably maintained long term in vitro. TPS cells shared features with 2-cell mouse embryos in terms of totipotency markers, transcriptome, chromatin accessibility and DNA methylation patterns. In vivo chimera formation assays show that these cells have embryonic and extraembryonic developmental potentials at the single-cell level. Moreover, TPS cells can be induced into blastocyst-like structures resembling preimplantation mouse blastocysts. Mechanistically, inhibition of HDAC1/2 and DOT1L activity and activation of RARγ signaling are important for inducing and maintaining totipotent features of TPS cells. Our study opens up a new path toward fully capturing totipotent stem cells in vitro.

Abstract High-grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) is characterised by recurrence, chemotherapy resistance and overall poor prognosis. Genetic heterogeneity of tumour cells and the microenvironment of the tumour have been hypothesised as key determinants of treatment resistance and relapse. Here, using a combination of spatial and single cell transcriptomics (10x Visium and Chromium platforms), we examine tumour genetic heterogeneity and infiltrating populations of HGSOC samples from eight patients with variable response to neoadjuvant chemotherapy. By inferring gross copy number alterations (CNAs), we identified distinct tumour subclones co-existing within individual tumour sections. These tumour subclones have unique CNA profiles and spatial locations within each tumour section, which were further validated by ultra-low-pass whole genome sequencing. Differential expression analysis between subclones within the same section identified both tumour cell intrinsic expression differences and markers indicative of different infiltrating cell populations. The gene sets differentially expressed between subclones were significantly enriched for genes encoding plasma membrane and secreted proteins, indicative of subclone-specific microenvironments. Furthermore, we identified tumour derived ligands with variable expression levels between subclones that correlated or anticorrelated with various non-malignant cell infiltration patterns. We highlight several of these that are potentially direct tumour-stroma/immune cell relationships as the non-malignant cell type expresses a cognate receptor for the tumour derived ligand. These include predictions of CXCL10-CXCR3 mediated recruitment of T and B cells to associate with the subclones of one patient and CD47-SIRPA mediated exclusion of macrophages from association with subclones of another. Finally, we show that published HGSOC molecular subtype signatures associated with prognosis are heterogeneously expressed across tumour sections and that areas containing different tumour subclones with different infiltration patterns can match different subtypes. Our study highlights the high degree of intratumoural subclonal and infiltrative heterogeneity in HGSOC which will be critical to better understand resistance and relapse.

ABSTRACT Parkinson’s disease (PD) is a complex, multi-factorial neurodegenerative disease, known to involve genetic, aging-related components, but also to be highly sensitive to environmental factors. In particular, ample evidence links pesticides to PD etiology. Here, establishing a field-to-bench paradigm, we have combined record-based exposure assessment in a population-based epidemiologic study of PD with testing in dopaminergic neurons produced from iPSCs to further identify and classify PD-relevant pesticides. First, agricultural pesticide-application records in California enabled us to investigate exposure to nearly 300 specific pesticides and PD risk in a comprehensive, pesticide-wide association study (PWAS). We implicated long-term exposure to 53 pesticide active ingredients in PD risk and identified their relevant co-exposure profiles. Second, to identify which of these pesticides might contribute to PD through direct effects on dopaminergic neurons, we employed a live-cell imaging screening paradigm in which neurons, definitively identified with a tyrosine hydroxylase reporter, were exposed to 43 of the high-risk pesticides. Using detailed morphometric measures, we found 10 pesticides were directly toxic to these neurons. Further, we analyzed pesticides typically used in combinations in cotton farming. Among these “cotton cluster” pesticides, co-exposures resulted in markedly greater toxicity than any single pesticide. Trifluralin was a pivotal driver of toxicity to dopaminergic neurons and led to marked mitochondrial dysfunction. Our field-to-bench paradigm may prove useful to mechanistically dissect pesticide exposure implicated in PD risk, and guide agricultural policy in the future.

Abstract Organoid cultures are widely used because they preserve many features of cancer cells in vivo . Here, we developed high-throughput oil-in-water droplet microtechnology to generate highly uniform, small-volume, multi-compartment organoids. Each organoid culture features a microenvironmental architecture that mimics both the basement membrane and stromal barriers. This matrix architecture, which allows accessing both proliferative and invasive features of cancer cells in a single platform, has profound effect on observed drug responsiveness and tumor progression that correlate well with in vivo and clinical outcomes. The method was tested on multiple types of cancer cells including primary cells and immortalized cell lines, and we determined our platform is suitable even for cells of poor organoid-forming ability. These new organoids also allow for direct orthotopic mouse implantation of cancer cells with unprecedented success.

Abstract Kluyveromyces marxianus is a food-safe yeast with great potential for producing heterologous proteins. Improving the yield in K. marxianus remains a challenge, while incorporating large-scale functional modules poses a technical obstacle in engineering. To address these issues, linear and circular yeast artificial chromosomes of K. marxianus (KmYACs) were constructed and loaded with disulfide bond formation modules from Pichia pastoris or K. marxianus . These modules contained up to 7 genes with a maximum size of 15 kb. KmYACs carried telomeres either from K. marxianus or Tetrahymena . KmYACs were transferred successfully into K. marxianus and stably propagated without affecting the normal growth of the host, regardless of the type of telomeres and configurations of KmYACs. KmYACs increased the overall expressions of disulfide bond formation genes and significantly enhanced the yield of various heterologous proteins. In high-density fermentation, the use of KmYACs resulted in a glucoamylase yield of 16.8 g/L, the highest reported level to date in K. marxianus . Transcriptomic and metabolomic analysis of cells containing KmYACs suggested increased FAD biosynthesis, enhanced flux entering the TCA cycle and a preferred demand for lysine and arginine as features of cells overexpressing heterologous proteins. Consistently, supplementing lysine or arginine further improved the yield. Therefore, KmYAC provides a powerful platform for manipulating large modules with enormous potential for industrial applications and fundamental research. Transferring the disulfide bond formation module via YACs proves to be an efficient strategy for improving the yield of heterologous proteins, and this strategy may be applied to optimize other microbial cell factories. Impact Statement In this study, yeast artificial chromosomes of K. marxianus (KmYACs) were constructed and successfully incorporating modules for large-scale disulfide bond formation. KmYACs were stably propagated in K. marxianus without compromising the normal growth of the host, irrespective of the selection of telomeres (either Tetrahymena or K. marxianus ) and configuration (either linear or circular). KmYACs notably enhanced the expressions of various heterologous proteins, with further yield improvement by supplementing lysine or arginine in the medium. Our findings affirm KmYAC as a robust and versatile platform for transferring large-scale function modules, demonstrating immense potential for both industrial applications and fundamental research.

Phased, secondary siRNAs (phasiRNAs) represent a class of small RNAs in plants generated via distinct biogenesis pathways, predominantly dependent on the activity of 22 nt miRNAs. Most 22 nt miRNAs are processed by DCL1 from miRNA precursors containing an asymmetric bulge, yielding a 22/21 nt miRNA/miRNA* duplex. Here we show that miR1510, a soybean miRNA capable of triggering phasiRNA production from numerous NB-LRRs, previously described as 21 nt in its mature form, primarily accumulates as a 22 nt isoform via monouridylation. We demonstrate that in Arabidopsis, this uridylation is performed by HESO1. Biochemical experiments showed that the 3' terminus of miR1510 is only partially 2'-O-methylated, because of the terminal mispairing in the miR1510/miR1510* duplex that inhibits HEN1 activity in soybean. miR1510 emerged in the Phaseoleae ~41 to 42 MYA with a conserved precursor structure yielding a 22 nt monouridylated form, yet a variant in mung bean is processed directly in a 22 nt mature form. This analysis of miR1510 yields two observations: (1) plants can utilize post-processing modification to generate abundant 22 nt miRNA isoforms to more efficiently regulate target mRNA abundances; (2) comparative analysis demonstrates an example of selective optimization of precursor processing of a young plant miRNA.

Locally advanced urothelial carcinoma has a poor survival despite a response to immunotherapy in approximately 25% of patients. To develop new therapies targeting other immune checkpoints, we identified increased expression of the T cell inhibitor protein, B7-H4 (VTCN1, B7S1, B7X), during tumor development of murine bladder cancer. Evaluation of B7-H4 in human bladder cancer by single-cell RNA-Seq and immune mass cytometry showed that B7-H4 is expressed by luminal tumors that are not normally responsive to PD-1 inhibitors. Additionally, overexpression B7-H4 was associated with significantly worse patient survival. In support of clinical translation, treatment of human monocyte and T cell co-cultures with a B7-H4 blocking antibody resulted in enhanced IFN-γ secretion by CD4+ and CD8+ T cell. While the study of B7-H4 in mouse cancer models has been difficult using tumor cell lines, our findings show that B7-H4 expression increased at 3 months after exposure to BBN on CD11b+ monocytes/macrophages and delivery of anti-B7-H4 antibody resulted in decreased tumor size and increased CD8 immune cell infiltration with increased CD8+/IFN-γ-producing T cells and a complimentary decrease in tumor infiltrating T regulatory cells (Tregs). Furthermore, treatment with a combination of anti-PD-1 and anti-B7-H4 antibodies resulted in a significant reduction in tumor stage. This data suggests that novel anti-B7-H4 antibodies maybe a viable target for bladder cancers unresponsive to PD-1 checkpoint inhibitors.

Cancer cells accumulate somatic mutations as result of DNA damage and inaccurate repair mechanisms. Different genetic instability processes result in distinct non-random patterns of DNA mutations, also known as mutational signatures. We developed mutSignatures, an integrated R-based computational framework aimed at deciphering DNA mutational signatures. Our software provides advanced functions for importing DNA variants, computing mutation types, and extracting mutational signatures via non-negative matrix factorization. We applied mutSignatures to analyze somatic mutations found in smoking-related cancer datasets. We characterized mutational signatures that were consistent with those reported before in independent investigations. Our work demonstrates that selected mutational signatures correlated with specific clinical and molecular features across different cancer types, and revealed complementarity of specific mutational patterns that has not previously been identified. In conclusion, we propose mutSignatures as a powerful open-source tool for detecting the molecular determinants of cancer and gathering insights into cancer biology and treatment.