Insights from the annotated wheat genome Wheat is one of the major sources of food for much of the world. However, because bread wheat's genome is a large hybrid mix of three separate subgenomes, it has been difficult to produce a high-quality reference sequence. Using recent advances in sequencing, the International Wheat Genome Sequencing Consortium presents an annotated reference genome with a detailed analysis of gene content among subgenomes and the structural organization for all the chromosomes. Examples of quantitative trait mapping and CRISPR-based genome modification show the potential for using this genome in agricultural research and breeding. Ramírez-González et al. exploited the fruits of this endeavor to identify tissue-specific biased gene expression and coexpression networks during development and exposure to stress. These resources will accelerate our understanding of the genetic basis of bread wheat. Science , this issue p. eaar7191 ; see also p. eaar6089

ARTICLE SUMMARY Transcription factors are vital in plants to regulate gene expression in response to environmental stimuli and to control developmental processes. In this study, we annotated and classified transcription factors in polyploid bread wheat into gene families and explored the NAC family in detail. We combined phylogenetic analysis and transcriptome analysis, using publicly available RNA-seq data, to characterize the NAC gene family and provide hypotheses for putative functions of many NAC transcription factors. This study lays the groundwork for future studies on transcription factors in wheat which may be of great agronomic relevance. ABSTRACT Many important genes in agriculture correspond to transcription factors which regulate a wide range of pathways from flowering to responses to disease and abiotic stresses. In this study, we identified 5,776 transcription factors in hexaploid wheat ( Triticum aestivum ) and classified them into gene families. We further investigated the NAC family exploring the phylogeny, C-terminal domain conservation and expression profiles across 308 RNA-seq samples. Phylogenetic trees of NAC domains indicated that wheat NACs divided into eight groups similar to rice ( Oryza sativa ) and barley ( Hordeum vulgare ). C-terminal domain motifs were frequently conserved between wheat, rice and barley within phylogenetic groups, however this conservation was not maintained across phylogenetic groups. We explored gene expression patterns across a wide range of developmental stages, tissues, and abiotic stresses. We found that more phylogenetically related NACs shared more similar expression patterns compared to more distant NACs. However, within each phylogenetic group there were clades with diverse expression profiles. We carried out a co-expression analysis on all wheat genes and identified 37 modules of co-expressed genes of which 23 contained NACs. Using GO term enrichment we obtained putative functions for NACs within co-expressed modules including responses to heat and abiotic stress and responses to water: these NACs may represent targets for breeding or biotechnological applications. This study provides a framework and data for hypothesis generation for future studies on NAC transcription factors in wheat.

Abstract Gene regulatory networks are powerful tools which facilitate hypothesis generation and candidate gene discovery. However, the extent to which the network predictions are biologically relevant is often unclear. Recently, as part of an analysis of the RefSeqv1.0 wheat transcriptome, a GENIE3 network which predicted targets of wheat transcription factors was produced. Here we have used an independent and publicly-available RNA-Seq dataset to validate the predictions of the wheat GENIE3 network for the senescence-regulating transcription factor NAM-A1 (TraesCS6A02G108300). We re-analysed the RNA-Seq data against the RefSeqv1.0 genome and identified a de novo set of differentially expressed genes (DEGs) between the wild-type and nam-a1 mutant which recapitulated the known role of NAM-A1 in senescence and nutrient remobilisation. We found that the GENIE3-predicted target genes of NAM-A1 overlap significantly with the de novo DEGs, more than would be expected for a random transcription factor. Based on high levels of overlap between GENIE3-predicted target genes and the de novo DEGs, we also identified a set of candidate senescence regulators. We then explored genome-wide trends in the network related to polyploidy and homoeolog expression levels and found that only homoeologous transcription factors are likely to share predicted targets in common. However, homoeologs in dynamic triads, i.e. with higher variation in homoeolog expression levels across tissues, are less likely to share predicted targets than stable triads. This suggests that homoeologs in dynamic triads are more likely to act on distinct pathways. This work demonstrates that the wheat GENIE3 network can provide biologically-relevant predictions of transcription factor targets, which can be used for candidate gene prediction and for global analyses of transcription factor function. The GENIE3 network has now been integrated into the KnetMiner web application, facilitating its use in future studies.

Abstract Dietary deficiencies of iron and zinc cause human malnutrition globally, which can be mitigated by biofortified staple crops. Conventional breeding approaches to increase grain mineral concentrations in wheat ( Triticum aestivum L.) have had only limited success so far due to relatively low genetic variation. Here we demonstrate that a transgenic approach combining endosperm-specific expression of the wheat vacuolar iron transporter gene TaVIT2-D with constitutive expression of the rice nicotianamine synthase gene OsNAS2 has the potential to dramatically improve mineral micronutrient intake from wheat products. In two distinct bread wheat cultivars, we show that the VIT-NAS construct led to a two-fold increase in zinc to ∼50 µg g -1 in wholemeal flour and a two-fold increase in both zinc and iron in hand-milled white flour. In highly pure, roller-milled white flour, the concentration of iron was enhanced three-fold to ∼25 µg g -1 . A greater than three-fold increase in the level of the natural plant metal chelator nicotianamine in the grain of VIT-NAS lines was associated with improved iron and zinc bioaccessibility in white flour. The growth of VIT-NAS plants in the greenhouse was indistinguishable from untransformed controls. We conclude that the effects of each gene cassette are additive in altering the total concentration and distribution of iron and zinc in wheat grains. This demonstrates the potential of a transgenic approach to enhance the nutritional quality of wheat well beyond what is possible by breeding approaches in order to alleviate dietary mineral deficiencies.

Abstract The Pisum sativum (pea) mutants degenerate leaves ( dgl ) and bronze ( brz ) accumulate large amounts of iron in leaves. First described several decades ago, the two mutants have provided important insights into iron homeostasis in plants but the underlying mutations have remained unknown. Using exome sequencing we identified an in-frame deletion associated with dgl in a BRUTUS homologue. The deletion is absent from wild type and the original parent line. BRUTUS belongs to a small family of E3 ubiquitin ligases acting as negative regulators of iron uptake in plants. The brz mutation was previously mapped to chromosome 4, and superimposing this region to the pea genome sequence uncovered a mutation in OPT3 , encoding an oligopeptide transporter with a plant-specific role in metal transport. The causal nature of the mutations was confirmed by additional genetic analyses. Identification of the mutated genes rationalises many of the previously described phenotypes and provides new insights into shoot-to-root signalling of iron deficiency. Furthermore, the non-lethal mutations in these essential genes suggest new strategies for biofortification of crops with iron. Significance statement Two iron-accumulating pea mutants first described more than 30 years ago have greatly contributed to our understanding of iron homeostasis in plants, but the mutations were never identified. Here we show that the phenotypes are caused by mutations in the BRUTUS and OPT3 genes and how this leads to specific defects in iron signalling and leaf development.

Durum wheat (Triticum turgidum) derives from a hybridization event approximately 400,000 years ago which led to the creation of an allotetraploid genome. Unlike with more ancient whole genome duplications, the evolutionary recent origin of durum wheat means that its genome has not yet been fully diploidised. As a result, many of the genes present in the durum genome act in a redundant fashion, meaning that, in many cases, loss-of-function mutations must be present in both gene copies to observe a phenotypic effect. This redundancy has hindered the use of forward genetic screens in durum wheat. Here we use a novel set of induced variation within the cv. Kronos TILLING population to identify a locus controlling a dominant, environmentally-dependent chlorosis phenotype. We carried out a forward screen of the sequenced cv. Kronos TILLING lines for senescence phenotypes and identified a single line with a dominant early senescence and chlorosis phenotype. Mutant plants contained overall less chlorophyll throughout their development and displayed premature flag leaf senescence. A segregating population was classified into discrete phenotypic groups and subjected to bulked-segregant analysis using exome capture followed by next-generation sequencing. This allowed the identification of a single region on chromosome 3A, Yellow Early Senescence 1 (YES-1), which was associated with the mutant phenotype. To obtain further SNPs for fine-mapping, we isolated chromosome 3A using flow sorting and sequenced the entire chromosome. By mapping these reads against both the cv. Chinese Spring reference sequence and the cv. Kronos assembly, we could identify high-quality, novel EMS-induced SNPs in non-coding regions within YES-1 that were previously missed in the exome capture data. This allowed us to fine-map YES-1 to 4.3 Mb, containing 59 genes. Our study shows that populations containing induced variation can be sources of novel dominant variation in polyploid crop species, highlighting their importance in future genetic screens. We also demonstrate the value of using cultivar-specific genome assemblies alongside the gold-standard reference genomes particularly when working with non-coding regions of the genome. Further fine-mapping of the YES-1 locus will be needed to identify the causal SNP underpinning this dominant, environmentally dependent phenotype.

Background: NAC transcription factors contain five highly conserved subdomains which are required for protein dimerisation and DNA binding. Few residues within these subdomains have been identified as essential for protein function, and fewer still have been shown to be of biological relevance in planta. Here we use a positive regulator of senescence in wheat, NAM-A1, to test the impact of missense mutations at specific, highly conserved residues of the NAC domain on protein function. Results: We identified missense mutations in five highly conserved residues of the NAC domain of NAM-A1 in a tetraploid TILLING population. TILLING lines containing these mutations, alongside synonymous and non-conserved mutation controls, were grown under glasshouse conditions and scored for senescence. Four of the five mutations showed a significant and consistent delay in peduncle senescence but had no consistent effects on flag leaf senescence. All four mutant alleles with the delayed senescence phenotype also lost the ability to interact with the homoeolog NAM-B1 in a yeast two-hybrid assay. Two of these residues were previously shown to be involved in NAC domain function in Arabidopsis, suggesting conservation of residue function between species. Three of these four alleles led to an attenuated cell death response compared to wild-type NAM-A1 when transiently over-expressed in Nicotiana benthamiana. One of these mutations was further tested under field conditions, in which there was a significant and consistent delay in both peduncle and leaf senescence. Conclusions: We combined field and glasshouse studies of a series of mutant alleles with biochemical analyses to identify four residues of the NAC domain which are required for NAM-A1 function and protein interaction. We show that mutations in these residues lead to a gradient of phenotypes, raising the possibility of developing allelic series of mutations for traits of agronomic importance. We also show that mutations in NAM-A1 more severely impact peduncle senescence, compared to the more commonly studied flag leaf senescence, highlighting this as an area deserving of further study. The results from this integrated approach provide strong evidence that conserved residues within the functional domains of NAC transcription factors have biological significance in planta.

Senescence is a tightly regulated developmental programme which is coordinated by transcription factors. Identifying these transcription factors in crops will provide opportunities to tailor the senescence process to different environmental conditions and regulate the balance between yield and grain nutrient content. Here we use ten time points of gene expression data alongside gene network modelling to identify transcription factors regulating senescence in polyploid wheat. We observe two main phases of transcription changes during senescence: early downregulation of housekeeping and metabolic processes followed by upregulation of transport and hormone related genes. We have identified transcription factor families associated with these early and later waves of differential expression. Using gene regulatory network modelling alongside complementary publicly available datasets we identified candidate transcription factors for controlling senescence. We validated the function of one of these candidate transcription factors in senescence using wheat chemically-induced mutants. This study lays the ground work to understand the transcription factors which regulate senescence in polyploid wheat and exemplifies the integration of time-series data with publicly available expression atlases and networks to identify candidate regulatory genes.

Abstract Background Functional characterisation of genes using transgenic methods is increasingly common in cereal crops. Yet standard methods of gene over-expression can lead to undesirable developmental phenotypes, or even embryo lethality, due to ectopic gene expression. Inducible expression systems allow the study of such genes by preventing their expression until treatment with the specific inducer. When combined with the Cre-Lox recombination system, inducible promoters can be used to initiate constitutive expression of a gene of interest. Yet while these systems are well established in dicot model plants, like Arabidopsis thaliana , they have not yet been implemented in grasses. Results Here we present an irreversible heat-shock inducible system developed using Golden Gate-compatible components which utilises Cre recombinase to drive constitutive gene expression in barley and wheat. We show that a heat shock treatment of 38 °C is sufficient to activate the construct and drive expression of the gene of interest. Modulating the duration of heat shock controls the density of induced cells. Short durations of heat shock cause activation of the construct in isolated single cells, while longer durations lead to global construct activation. The system can be successfully activated in multiple tissues and at multiple developmental stages and shows no activation at standard growth temperatures (~ 20 °C). Conclusions This system provides an adaptable framework for use in gene functional characterisation in cereal crops. The developed vectors can be easily adapted for specific genes of interest within the Golden Gate cloning system. By using an environmental signal to induce activation of the construct, the system avoids pitfalls associated with consistent and complete application of chemical inducers. As with any inducible system, care must be taken to ensure that the expected construct activation has indeed taken place.