Antimicrobial peptides are promising alternative antimicrobial agents. However, little is known about whether resistance to small-molecule antibiotics leads to cross-resistance (decreased sensitivity) or collateral sensitivity (increased sensitivity) to antimicrobial peptides. We systematically addressed this question by studying the susceptibilities of a comprehensive set of 60 antibiotic-resistant Escherichia coli strains towards 24 antimicrobial peptides. Strikingly, antibiotic-resistant bacteria show a high frequency of collateral sensitivity to antimicrobial peptides, whereas cross-resistance is relatively rare. We identify clinically relevant multidrug-resistance mutations that increase bacterial sensitivity to antimicrobial peptides. Collateral sensitivity in multidrug-resistant bacteria arises partly through regulatory changes shaping the lipopolysaccharide composition of the bacterial outer membrane. These advances allow the identification of antimicrobial peptide–antibiotic combinations that enhance antibiotic activity against multidrug-resistant bacteria and slow down de novo evolution of resistance. In particular, when co-administered as an adjuvant, the antimicrobial peptide glycine-leucine-amide caused up to 30-fold decrease in the antibiotic resistance level of resistant bacteria. Our work provides guidelines for the development of efficient peptide-based therapies of antibiotic-resistant infections. Multidrug-resistant Escherichia coli have a high frequency of collateral sensitivity to antimicrobial peptides, which may arise from changes in lipopolysaccharide regulation.

Abstract Understanding how evolution of antimicrobial resistance increases resistance to other drugs is a challenge of profound importance. By combining experimental evolution and genome sequencing of 63 laboratory-evolved lines, we charted a map of cross-resistance interactions between antibiotics in Escherichia coli , and explored the driving evolutionary principles. Here, we show that (1) convergent molecular evolution is prevalent across antibiotic treatments, (2) resistance conferring mutations simultaneously enhance sensitivity to many other drugs and (3) 27% of the accumulated mutations generate proteins with compromised activities, suggesting that antibiotic adaptation can partly be achieved without gain of novel function. By using knowledge on antibiotic properties, we examined the determinants of cross-resistance and identified chemogenomic profile similarity between antibiotics as the strongest predictor. In contrast, cross-resistance between two antibiotics is independent of whether they show synergistic effects in combination. These results have important implications on the development of novel antimicrobial strategies.

Significance Current tools for bacterial genome engineering suffer from major limitations. They have been optimized for a few laboratory model strains, lead to the accumulation of numerous undesired, off-target modifications, and demand extensive modification of the host genome prior to large-scale editing. Herein, we address these problems and present a simple, all-in-one solution. By utilizing a highly conserved mutant allele of the bacterial mismatch-repair system, we were able to gain unprecedented precision in the control over the generation of desired modifications in multiple bacterial species. These results have broad implications with regards to both biotechnological and clinical applications.

Abstract Removing cellular transfer RNAs (tRNAs), making their cognate codons unreadable, creates a genetic firewall that prevents viral replication and horizontal gene transfer. However, numerous viruses and mobile genetic elements encode parts of the translational apparatus, including tRNAs, potentially rendering a genetic-code-based firewall ineffective. In this paper, we show that such horizontally transferred tRNA genes can enable viral replication in Escherichia coli cells despite the genome-wide lack of three codons and the previously essential cognate tRNAs and release factor 1. By repurposing viral tRNAs, we then develop recoded cells bearing an amino-acid-swapped genetic code that reassigns two of the six serine codons to leucine during translation. This amino-acid-swapped genetic code renders cells completely resistant to viral infections by mistranslating viral proteomes and prevents the escape of synthetic genetic information by engineered reliance on serine codons to produce leucine-requiring proteins. Finally, we also repurpose the third free codon to biocontain this virus-resistant host via dependence on an amino acid not found in nature.

Engineering the genetic code of an organism provides the basis for (i) making any organism safely resistant to natural viruses and (ii) preventing genetic information flow into and out of genetically modified organisms while (iii) allowing the biosynthesis of genetically encoded unnatural polymers

SUMMARY In vivo evolution of antibodies facilitates emergence of novel target specificities from pre-existing clones. In this work we show how mutagenic ssDNA recombineering of camel-derived nanobodies encoded in a bacterial genome enables clonal hyper-diversification and the rise of new properties. As a proof-of-principle we used a nanobody recognizing the antigen TirM from enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) and evolved it towards the otherwise not recognized TirM antigen from enteropathogenic E. coli (EPEC). To this end, E. coli cells displaying on their surface this nanobody fused to the intimin outer membrane anchor domain were subjected to multiple rounds of mutagenic ssDNA recombineering targeted to the CDR1, CDR2 and CDR3 regions of its genomically encoded V HH sequence. Binders to the new antigen (EPEC TirM) were then selected upon immunomagnetic capture of bacteria bearing the corresponding nanobody variants. As a result, several modified nanobodies were identified which maintained recognition of EHEC TirM but acquired the ability to bind the new antigen with high affinity (Kd ~20 nM). The results highlight the power of combining evolutionary properties of bacteria in vivo with oligonucleotide synthesis in vitro for the sake of focusing diversification to specific segments of a gene (or protein thereof) of interest. Our experimental workflow empowers the evolution of nanobodies displayed on the surface of bacterial cells for a large number of potential applications in medical and industrial biotechnology.

Evidence suggests that novel enzyme functions evolved from low-level promiscuous activities in ancestral enzymes. Yet, the evolutionary dynamics and physiological mechanisms of how such side activities contribute to systems-level adaptations are poorly understood. Furthermore, it remains untested whether knowledge of an organism's promiscuous reaction set ('underground metabolism') can aid in forecasting the genetic basis of metabolic adaptations. Here, we employ a computational model of underground metabolism and laboratory evolution experiments to examine the role of enzyme promiscuity in the acquisition and optimization of growth on predicted non-native substrates in E. coli K-12 MG1655. After as few as 20 generations, the evolving populations repeatedly acquired the capacity to grow on five predicted novel substrates--D-lyxose, D-2-deoxyribose, D-arabinose, m-tartrate, and monomethyl succinate--none of which could support growth in wild-type cells. Promiscuous enzyme activities played key roles in multiple phases of adaptation. Altered promiscuous activities not only established novel high-efficiency pathways, but also suppressed undesirable metabolic routes. Further, structural mutations shifted enzyme substrate turnover rates towards the new substrate while retaining a preference for the primary substrate. Finally, genes underlying the phenotypic innovations were accurately predicted by genome-scale model simulations of metabolism with enzyme promiscuity. Computational approaches will be essential to synthesize the complex role of promiscuous activities in applied biotechnology and in models of evolutionary adaptation.

The mismatch repair (MMR) system is one of the key molecular devices that prokaryotic cells have for ensuring fidelity of DNA replication. While the canonical MMR of E. coli involves 3 proteins (encoded by mutS, mutL and mutH), the soil bacterium Pseudomonads putida has only 2 bona fide homologues (mutS and mutL) and the sensitivity of this abridged system to different types of mismatches is unknown. On this background, sensitivity to MMR of this bacterium was inspected through single stranded (ss) DNA recombineering of the pyrF gene (the prokaryotic equivalent to yeast's URA3) with mutagenic oligos representative of every possible mispairing under either wild-type conditions, permanent deletion of mutS or transient loss of mutL activity (brought about by the thermoinducible dominant negative allele mutLE36K). Analysis of single nucleotide mutations borne by clones resistant to fluoroorotic acid (5FOA, the target of wild type PyrF) pinpointed prohibited and tolerated single-nucleotide replacements and exposed a clear grading of mismatch recognition. The resulting data unequivocally established the hierarchy A:G< C:C< G:A< C:A, A:A, G:G, T:T, T:G, A:C, C:T< G:T, T:C as the one prevalent in Pseudomonas putida. This information was vital for enabling recombineering strategies aimed at single-nucleotide changes in this biotechnologically important species.

Multi-targeting antibiotics, i.e. single compounds capable to inhibit two or more bacterial targets offer a promising therapeutic strategy, but information on resistance evolution against such drugs is scarce. Gepotidacin is an antibiotic candidate that selectively inhibits both bacterial DNA gyrase and topoisomerase IV. In a susceptible organism, Klebsiella pneumoniae, a combination of two specific mutations in these target proteins provide an over 2000-fold increment in resistance, while individually none of these mutations affect resistance significantly. Alarmingly, gepotidacin-resistant strains are found to be as virulent as the wild-type K. pneumoniae strain in a murine model, and extensive cross-resistance was demonstrated between gepotidacin and ciprofloxacin, a fluoroquinolone antibiotic widely employed in clinical practice. This suggests that numerous fluoroquinolone-resistant pathogenic isolates carry mutations which would promote the evolution of clinically significant resistance against gepotidacin in the future. We conclude that prolonged antibiotic usage could select for mutations that serve as stepping-stones towards resistance against antimicrobial compounds still under development. More generally, our research indicates that even balanced multi-targeting antibiotics are prone to resistance evolution.

Exploiting bacteriophage-derived homologous recombination processes has enabled precise, multiplex editing of microbial genomes and the construction of billions of customized genetic variants in a single day. The techniques that enable this, Multiplex Automated Genome Engineering (MAGE) and directed evolution with random genomic mutations (DIvERGE), are however currently limited to a handful of microorganisms for which single-stranded DNA-annealing proteins (SSAPs) that promote efficient recombineering have been identified. Thus, to enable genome-scale engineering in new hosts, highly efficient SSAPs must first be found. Here we introduce a high-throughput method for SSAP discovery that we call Serial Enrichment for Efficient Recombineering (SEER). By performing SEER in E. coli to screen hundreds of putative SSAPs, we identify highly active variants PapRecT and CspRecT. CspRecT increases the efficiency of single-locus editing to as high as 50% and improves multiplex editing by 5 to 10-fold in E. coli, while PapRecT enables efficient recombineering in Pseudomonas aeruginosa, a concerning human pathogen. CspRecT and PapRecT are also active in other, clinically and biotechnologically relevant enterobacteria. We envision that the deployment of SEER in new species will pave the way toward pooled interrogation of genotype-to-phenotype relationships in previously intractable bacteria.