Polysaccharide Breakdown One of the current challenges in the biofuels industry is achieving efficient bioconversion of complex polysaccharides like cellulose and chitin. Recently, chitin-binding proteins (CBPs) have been identified that potentiate chitin hydrolysis. Now, Vaaje-Kolstad et al. (p. 219 ) show that a CBP from the chitinolytic bacterium Serratia marcescens appears to catalyze an oxygenase reaction on the surface of crystallized chitin, leading to chain breakage and generating oxidized ends that can be degraded by chitinases. A structurally similar enzyme, GH61, may play a similar role in the degradation of cellulose.

Abstract Bacterial proteins categorized as family 33 carbohydrate‐binding modules (CBM33) were recently shown to cleave crystalline chitin, using a mechanism that involves hydrolysis and oxidation. We show here that some members of the CBM33 family cleave crystalline cellulose as demonstrated by chromatographic and mass spectrometric analyses of soluble products released from Avicel or filter paper on incubation with CelS2, a CBM33‐containing protein from Streptomyces coelicolor A3(2). These enzymes act synergistically with cellulases and may thus become important tools for efficient conversion of lignocellulosic biomass. Fungal proteins classified as glycoside hydrolase family 61 that are known to act synergistically with cellulases are likely to use a similar mechanism.

Significance The discovery of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) has profoundly changed our understanding of the enzymatic conversion of recalcitrant polysaccharides, such as cellulose. Although in-depth studies of fungal cellulolytic LPMOs have been reported, the structures and functions of their bacterial counterparts with no detectable sequence similarity remain largely elusive. We present the structures of a conserved pair of bacterial cellulose-active LPMOs supplemented with extensive functional characterization. The structural data allow a thorough comparative assessment of fungal and bacterial LPMOs, providing insight into the structural basis of substrate specificity and the oxidative mechanism (C1/C4 oxidation). Importantly, we show that this LPMO pair acts synergistically when degrading cellulose, a finding that may help explain the occurrence of multiple LPMOs in a single microbe.

Lytic polysaccharide monooxygenases currently classified as carbohydrate binding module family 33 (CBM33) and glycoside hydrolase family 61 (GH61) are likely to play important roles in future biorefining. However, the molecular basis of their unprecedented catalytic activity remains largely unknown. We have used NMR techniques and isothermal titration calorimetry to address structural and functional aspects of CBP21, a chitin-active CBM33. NMR structural and relaxation studies showed that CBP21 is a compact and rigid molecule, and the only exception is the catalytic metal binding site. NMR data further showed that His28 and His114 in the catalytic center bind a variety of divalent metal ions with a clear preference for Cu 2+ ( K d = 55 nM; from isothermal titration calorimetry) and higher preference for Cu 1+ ( K d ∼ 1 nM; from the experimentally determined redox potential for CBP21-Cu 2+ of 275 mV using a thermodynamic cycle). Strong binding of Cu 1+ was also reflected in a reduction in the p K a values of the histidines by 3.6 and 2.2 pH units, respectively. Cyanide, a mimic of molecular oxygen, was found to bind to the metal ion only. These data support a model where copper is reduced on the enzyme by an externally provided electron and followed by oxygen binding and activation by internal electron transfer. Interactions of CBP21 with a crystalline substrate were mapped in a 2 H/ 1 H exchange experiment, which showed that substrate binding involves an extended planar binding surface, including the metal binding site. Such a planar catalytic surface seems well-suited to interact with crystalline substrates.

Abstract Chitin is a highly abundant polysaccharide in nature and linked to immune recognition of fungal infections and asthma in humans. Ubiquitous in fungi and insects, chitin is absent in mammals and plants and, thus, represents a microbe-associated molecular pattern (MAMP). However, the highly polymeric chitin is insoluble, which potentially hampers recognition by host immune sensors. In plants, secreted chitinases degrade polymeric chitin into diffusible oligomers, which are ‘fed to’ innate immune receptors and co-receptors. In human and murine immune cells, a similar enzymatic activity was shown for human chitotriosidase (CHIT1) and oligomeric chitin is sensed via an innate immune receptor, Toll-like receptor (TLR) 2. However, a complete system of generating MAMPs from chitin and feeding them into a specific receptor/co-receptor-aided sensing mechanism has remained unknown in mammals. Here, we show that the secreted chitinolytic host enzyme, CHIT1, converts inert polymeric chitin into diffusible oligomers that can be sensed by TLR1-TLR2 co-receptor/receptor heterodimers, a process promoted by the lipopolysaccharide binding protein (LBP) and CD14. Furthermore, we observed that Chit1 is induced via the β-glucan receptor Dectin-1 upon direct contact of immortalized human macrophages to the fungal pathogen Candida albicans , whereas the defined fungal secreted aspartyl proteases, Sap2 and Sap6, from C. albicans were able to degrade CHIT1 in vitro. Our study shows the existence of an inducible system of MAMP generation in the human host that enables contact-independent immune activation by diffusible MAMP ligands with striking similarity to the plant kingdom. Moreover, this study highlights CHIT1 as a potential therapeutic target for TLR2-mediated inflammatory processes that are fueled by oligomeric chitin.

A lytic polysaccharide monooxygenase's ligands and their electronic influences are revealed by advanced electron paramagnetic resonance spectroscopies.