G-protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of transmembrane signaling proteins in the human genome. Events in the GPCR signaling cascade have been well characterized, but the receptor composition and its membrane distribution are still generally unknown. Although there is evidence that some members of the GPCR superfamily exist as constitutive dimers or higher oligomers, interpretation of the results has been disputed, and recent studies indicate that monomeric GPCRs may also be functional. Because there is controversy within the field, to address the issue we have used total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) in living cells to visualize thousands of individual molecules of a model GPCR, the M(1) muscarinic acetylcholine receptor. By tracking the position of individual receptors over time, their mobility, clustering, and dimerization kinetics could be directly determined with a resolution of approximately 30 ms and approximately 20 nm. In isolated CHO cells, receptors are randomly distributed over the plasma membrane. At any given time, approximately 30% of the receptor molecules exist as dimers, and we found no evidence for higher oligomers. Two-color TIRFM established the dynamic nature of dimer formation with M(1) receptors undergoing interconversion between monomers and dimers on the timescale of seconds.

The generation of high-affinity antibodies depends on the ability of B cells to extract antigens from the surfaces of antigen-presenting cells. B cells that express high-affinity B cell receptors (BCRs) acquire more antigen and obtain better T cell help. However, the mechanisms by which B cells extract antigen remain unclear. Using fluid and flexible membrane substrates to mimic antigen-presenting cells, we showed that B cells acquire antigen by dynamic myosin IIa-mediated contractions that pull out and invaginate the presenting membranes. The forces generated by myosin IIa contractions ruptured most individual BCR-antigen bonds and promoted internalization of only high-affinity, multivalent BCR microclusters. Thus, B cell contractility contributes to affinity discrimination by mechanically testing the strength of antigen binding.

Abstract Malaria is responsible for half a million deaths annually and poses a huge economic burden on the developing world. The mosquito-borne parasites ( Plasmodium spp.) that cause the disease depend upon an unconventional actomyosin motor for both gliding motility and host cell invasion. The motor system, often referred to as the glideosome complex, remains to be understood in molecular terms and is an attractive target for new drugs that might block the infection pathway. Here, we present the first high-resolution structure of the actomyosin motor complex from Plasmodium falciparum . Our structure includes the malaria parasite actin filament ( Pf Act1) complexed with the myosin motor ( Pf MyoA) and its two associated light-chains. The high-resolution core structure reveals the Pf Act1: Pf MyoA interface in atomic detail, while at lower-resolution, we visualize the Pf MyoA light-chain binding region, including the essential light chain ( Pf ELC) and the myosin tail interacting protein ( Pf MTIP). Finally, we report a bare Pf Act1 filament structure at an improved resolution, which gives new information about the nucleotide-binding site, including the orientation of the ATP/ADP sensor, Ser15, and the presence of a channel, which we propose as a possible phosphate exit path after ATP hydrolysis. Significance statement We present the first structure of the malaria parasite motor complex; actin 1 ( Pf Act1) and myosin A ( Pf MyoA) with its two light chains. We also report a high-resolution structure of filamentous Pf Act1 that reveals new atomic details of the ATPase site, including a channel, which may provide an exit route for phosphate and explain why phosphate release is faster in Pf Act1 compared to canonical actins. Pf Act1 goes through no conformational changes upon Pf MyoA binding. Our Pf MyoA structure also superimposes with a recent crystal structure of Pf MyoA alone, though there are small but important conformational changes at the interface. Our structures serve as an excellent starting point for drug design against malaria, which is one of the most devastating infectious diseases.

Abstract The calcium calmodulin protein kinase II (CaMKII) is a multi-subunit ring assembly with a central hub formed by the association domains. There is evidence for hub polymorphism between and within CaMKII isoforms, but the link between polymorphism and subunit exchange has not been resolved. Here, we present near-atomic resolution cryogenic electron microscopy (cryo-EM) structures revealing that hubs from the α and β isoforms, either standalone or within an β holoenzyme, coexist as 12 and 14 subunit assemblies. Single-molecule fluorescence microscopy of Venus-tagged holoenzymes detects intermediate assemblies and progressive dimer loss due to intrinsic holoenzyme lability, and holoenzyme disassembly into dimers upon mutagenesis of a conserved inter-domain contact. Molecular dynamics (MD) simulations show the flexibility of 4-subunit precursors, extracted in-silico from the β hub polymorphs, encompassing the curvature of both polymorphs. The MD explains how an open hub structure also obtained from the β holoenzyme sample could be created by dimer loss and analysis of its cryo-EM dataset reveals how the gap could open further. An assembly model, considering dimer concentration dependence and strain differences between polymorphs, proposes a mechanism for intrinsic hub lability to fine-tune the stoichiometry of αβ heterooligomers for their dynamic localization within synapses in neurons.

ABSTRACT Poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) is an abundant nuclear enzyme that plays important roles in DNA repair, chromatin organization and transcription regulation. Although binding and activation of PARP1 by DNA damage sites has been extensively studied, little is known about how PARP1 binds to long stretches of undamaged DNA and how it could shape chromatin architecture. Here, using a combination of single-molecule techniques including magnetic tweezers and atomic force microscopy, we show that PARP1 binds and condenses undamaged, kilobase-length DNA subject to sub-picoNewton mechanical forces. Decondensation by high force proceeds through a series of discrete increases in extension, indicating that PARP1 stabilizes loops of DNA. This model is supported by DNA braiding experiments which show that PARP1 can bind at the intersection of two separate DNA molecules. PARP inhibitors do not affect the level of condensation of undamaged DNA, but act to block condensation reversal for damaged DNA in the presence of NAD + . Our findings establish a mechanism for PARP1 in the organization of chromatin structure.

All cells have the ability to respond to changes in their environment. Signalling networks modulate cytoskeleton and membrane organisation to impact cell cycle progression, polarised cell growth and multicellular development according to the environmental setting. Using diverse in vitro, in vivo and single molecule techniques we have explored the role of myosin-1 signalling in regulating endocytosis during both mitotic and meiotic cell cycles. We have established that a conserved serine within the neck region of the sole fission yeast myosin-1 is phosphorylated in a TORC2 dependent manner to modulate myosin function. Myo1 neck phosphorylation brings about a change in the conformation of the neck region and modifies its interaction with calmodulins, Myo1 dynamics at endocytic foci, and promotes calcium dependent switching between different calmodulin light chains. These data provide insight into a novel mechanism by which myosin neck phosphorylation modulates acto-myosin dynamics to control polarised cell growth in response to mitotic and meiotic cell-cycle progression and the cellular environment.

Abstract To improve access to advanced optical microscopy in educational and resource-limited settings we have developed the eduWOSM ( Edu cational W arwick O pen S ource Mic roscope), an open hardware platform for transmitted-light and epifluorescence imaging in up to 4 colours, including single molecule imaging. EduWOSMs are robust, monolithic, portable and ultra-stable instruments that are remotely computer-controllable and integrated with open-source software packages. Here we describe the core eduWOSM technology and benchmark its performance using 3 example projects, single molecule tracking of fluorescent tubulin heterodimers within gliding microtubules, 4-D (deconvolution) imaging/tracking of chromosome motions in dividing human cells, and automated single particle tracking in vitro and in live cells with classification into subdiffusive, diffusive and superdiffusive motion.

Abstract Myosin B (MyoB) is a class 14 myosin expressed in all invasive stages of the malaria parasite, Plasmodium falciparum . It is not associated with the glideosome complex that drives motility and invasion of host cells. During red blood cell invasion, it remains at the apical tip of the merozoite but is no longer observed once invasion is completed. MyoB is not essential for parasite survival but, when it is knocked out, merozoites are delayed in the initial stages of red blood cell invasion, giving rise to a growth defect that correlates with reduced invasion success. Here, we have expressed and purified functional MyoB with the help of parasite-specific chaperones Hsp90 and Unc45, characterized its binding to actin and its known light chain MLC-B using biochemical and biophysical methods, and determined its low-resolution structure in solution using small-angle X-ray scattering. In addition to MLC-B, four other putative regulatory light chains were found to bind to the MyoB IQ2 motif in vitro . The purified recombinant MyoB adopted the overall shape of a myosin, exhibited actin-activated ATPase activity, and moved actin filaments in vitro . The ADP release rate was faster than the ATP turnover number, and thus, does not appear to be rate-limiting. This, together with the observed high affinity to actin and the specific localization of MyoB, may point towards a role in tethering and/or force sensing during early stages of invasion.

Calcium calmodulin dependent kinase (CaMKII) has an important role in dendritic spine remodelling upon synaptic stimulation. Using fluorescence video microscopy and image analysis, we investigated the architectural dynamics of rhodamine-phalloidin stabilized F-actin networks cross-linked by CaMKII. We used automated image analysis to identify F-actin bundles and cross-over junctions and developed a dimensionless metric to characterize network architecture. Similar networks were formed by three different CaMKII species with ten-fold length difference in the linker region between the kinase domain and holoenzyme hub; implying linker length is not a primary determinant of F-actin binding. Electron micrographs showed that, at physiological molar ratios, single CaMKII holoenzymes cross-linked multiple F-actin filaments in random networks, whereas at higher CaMKII / F-actin ratios filaments bundled. Light microscopy established that random networks resisted macromolecular crowding, with polyethylene glycol mimicking cytoplasmic osmolarity, and blocked ATP-powered compaction by myosin-2 mini-filaments. Importantly, the networks disassembled following addition of calcium calmodulin and were then rapidly spaced into compacted foci by myosin motors or, more slowly, aggregated by crowding. Single molecule TIRF microscopy showed CaMKII dissociation from surface-immobilized G-actin exhibited a mono-exponential dwell-time distribution, whereas CaMKII bound to F-actin networks had a long-lived fraction, trapped at cross-over junctions. Release of CaMKII from F-actin, triggered by calcium calmodulin did not require ATP (hence phosphorylation) and was too rapid to measure with video-rate imaging. The residual bound-fraction was reduced substantially upon addition of an NMDA receptor peptide analogue. These results provide mechanistic insights to CaMKII-actin interactions at the collective network and single molecule level. Our findings argue that CaMKII-actin networks in dendritic spines are stable enough to protect the basal network architecture against physical stress but once CaMKII is disengaged by calcium calmodulin and sequestered by receptors at the synapse; F-actin compaction by myosin motors stabilizes the expanded spine compatible with the recorded times.