ABSTRACT Switching hemoglobin synthesis from defective adult beta-globin to fetal gamma-globin is an effective strategy for the treatment of beta-hemoglobinopathies. Fetal hemoglobin expression is down-regulated in the postnatal period due to the interplay of transcription regulators with the HBG promoters. However, in the hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH) condition, naturally occurring point mutations in the HBG promoter causes continued expression of fetal globin even during adulthood. Inspired by this natural phenomenon, we screened the proximal promoter of human HBG genes using adenine and cytosine base editors to identify other nucleotide substitutions that could potentially lead to elevated levels of fetal globin. Both the base editors efficiently and precisely edited at the target sites with a minimal generation of indels and no deletion of one of the duplicated HBG genes. Through systematic tiling across the HBG proximal promoter, we identified multiple novel target sites that resulted in a significant increase in fetal globin levels. Further, we individually validated the top eight potential target sites from both the base editors and observed robust elevation in the fetal globin levels up to 47 %, without any detrimental effects on erythroid differentiation. Our screening strategy resulted in the identification of multiple novel point mutations and also validated the known non-deletional HPFH mutations that could elevate the fetal globin expression at therapeutically relevant levels. Overall, our findings shed light on so far unknown regulatory elements within the HBG promoter that normally mediates fetal globin silencing and identify additional targets for therapeutic upregulation of fetal hemoglobin.

Factor induced pluripotent stem cells offer great promise in regenerative medicine. However, accumulating evidence suggest that iPSCs are heterogeneous in comparison with embryonic stem cells and that is attributed to various genetic and epigenetic states of donor cells. In light of discovery of cell-type specific specialized ribosomal protein composition, its role as the cells transit through different stages of reprogramming and iPSCs differentiation into specialized cell-types has not been explored as it might influence reprogramming /differentiation process and outcome. By re-analyzing the publicly available gene expression datasets among ESCs, various sources of iPSCs and somatic cells, we have studied ribosomal protein gene expression during different stages of reprogramming of somatic cells and different passages of established iPSCs and found distinct patterns across multiple cell types. We experimentally validated these results on cells undergoing reprogramming from human dermal fibroblasts. Finally, by comparing publicly available data from iPSCs, iPSCs derived specialized cells and its in vivo counterparts, we show alterations in ribosomal gene expression during differentiation of specialized cells from iPSCs which may have Implications in the context of ribosomopathies. Our results provide an informatics framework for researchers in efficient generation of iPSCs equivalent to that of ESCs.

Abstract Induced pluripotent stem cells (iPSCs) generated from patients with chronic myeloid leukemia (CML) have the potential for disease modeling to study disease pathogenesis and screening therapeutic interventions. In this study, we aimed to generate iPSCs from CD34 + hematopoietic progenitors of CML patients with varying responses to tyrosine kinase inhibitor (TKI) therapy. The generated CML-CD34-iPSC colonies displayed atypical “dome-shaped” morphology and underwent spontaneous differentiation in a few days. However, supplementation with imatinib (IM), the most widely used TKI to treat CML patients, in the culture medium improved the stability and maintenance of all isolated CML-CD34-iPSC colonies, allowing them to be maintained for more than 20 passages without significant differentiation. In contrast to previous studies, our results indicate that suppressing the BCR::ABL1 oncogenic pathway is essential for efficiently generating stable CML-iPSC colonies. Furthermore, we successfully differentiated these iPSCs to CD34 + hematopoietic progenitors both in the presence and absence of IM. This robust protocol for generating CML-iPSCs provides a valuable resource for disease modelling. The generated iPSCs will be a valuable tool for investigating CML pathophysiology, drug resistance mechanisms, and drug screening to identify novel and effective therapies for this disease.

Abstract Base editing in gamma-globin promoter is a promising approach for reactivation of fetal-hemoglobin. Recent studies have shown that base editing could result in genotoxic events at the gamma globin locus including 4.9 kb large deletion of intervening region due to nicking in the paralogous HBG 1 and HBG 2 genes. Although the deletion frequency is less than what is observed with Cas9, it could diminish the therapeutic potential. We sought to evaluate if large deletion could be overcome while maintaining the editing efficiency by replacing the nCas9 of ABE8e with a catalytically inactive deadCas9 (dCas9). Using 3 therapeutically relevant gRNAs targeting the gamma globin promoter, we performed a comprehensive evaluation of the editing outcome and frequency of large deletion using dCas9, nCas9, dCas9-ABE8e and nCas9-ABE8e. Our findings indicate that while nicking in itself induced large deletions, the frequency reduced upon efficient base editing. Notably, there was no appreciable deletion with the use of dCas9-ABE8e making it a safer approach, in terms of genome integrity, for therapeutic genome editing in the gamma-globin locus. Further, we also demonstrate that dCas9 ABE8e can edit efficiently in primary human CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) to achieve therapeutic benefits.

Abstract β-thalassemia and HbE result from mutations in the β-globin locus that impedes the production of functional β-hemoglobin and represents one of the most common genetic disorders worldwide. Recent advances in genome engineering have opened up new therapeutic opportunities to directly correct these pathogenic mutations using base editors that install transition mutations (A>G and C>T) in the target region with minimal generation of indels. Herein, for the first time, we demonstrate the usage of base editor in the correction of point mutations spanning multiple regions of the HBB gene, including promoter, intron and exon. To this end, we have engineered human erythroid cells harbouring the diverse HBB mutations, thus eliminating the requirement of patient CD34+ HSPCs with desired mutations for the primary screening by base editors. We further performed precise creation and correction of individual HBB point mutations in human erythroid cells using base editors, which were effectively corrected in the HBB-engineered erythroid model. Intriguingly, most bystander effects produced by the base editor at the target site were reported to exhibit normal hemoglobin variants. Overall, our study provides the proof-of-concept for the precise, efficient and scarless creation and correction of various pathogenic mutations at the coding and non-coding regions of HBB gene in human erythroid cells using base editors and establishes a novel therapeutic platform for the treatment of β-thalassemia/HbE patients. This study can be further explored in correcting the other monogenic disorders caused due to single base substitutions.

Abstract Reactivation of fetal hemoglobin (HbF) is the commonly adapted strategy to ameliorate β-hemoglobinopathies. However, the continued production of defective adult hemoglobin (HbA) limits the HbF tetramer production affecting the therapeutic benefits. Here, we tested various deletional hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH) mutations and identified a 11 kb sequence, encompassing Putative Repressor Region (PRR) to β-globin Exon-1 (βE1), as the core deletion that ablates HbA and exhibit superior production of HbF compared to HPFH or other well-established targets. The PRR-βE1 edited hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) retained engraftment potential to repopulate for long-term hematopoiesis in immunocompromised mice generating HbF+ cells in vivo. Importantly, the editing induces therapeutically relevant levels of HbF to reverse the phenotypes of both sickle cell disease and β-thalassemia major. These results indicate that the PRR-βE1 gene editing in patient HSPCs can potentially lead to superior therapeutic outcomes for β-hemoglobinopathies gene therapy.