Mitochondria are key organelles for cellular energetics, metabolism, signaling, and quality control and have been linked to various diseases. Different views exist on the composition of the human mitochondrial proteome. We classified >8,000 proteins in mitochondrial preparations of human cells and defined a mitochondrial high-confidence proteome of >1,100 proteins (MitoCoP). We identified interactors of translocases, respiratory chain, and ATP synthase assembly factors. The abundance of MitoCoP proteins covers six orders of magnitude and amounts to 7% of the cellular proteome with the chaperones HSP60-HSP10 being the most abundant mitochondrial proteins. MitoCoP dynamics spans three orders of magnitudes, with half-lives from hours to months, and suggests a rapid regulation of biosynthesis and assembly processes. 460 MitoCoP genes are linked to human diseases with a strong prevalence for the central nervous system and metabolism. MitoCoP will provide a high-confidence resource for placing dynamics, functions, and dysfunctions of mitochondria into the cellular context.

Summary Hsp70 interactions are critical for cellular viability and the response to stress. Previous attempts to characterize Hsp70 interactions have been limited by their transient nature and inability of current technologies to distinguish direct vs bridged interactions. We report the novel use of cross-linking mass spectrometry (XL-MS) to comprehensively characterize the budding yeast Hsp70 protein interactome. Using this approach, we have gained fundamental new insights into Hsp70 function, including definitive evidence of Hsp70 self-association as well as multi-point interaction with its client proteins. In addition to identifying a novel set of direct Hsp70 interactors which can be used to probe chaperone function in cells, we have also identified a suite of PTM-associated Hsp70 interactions. The majority of these PTMs have not been previously reported and appear to be critical in the regulation of client protein function. These data indicate that one of the mechanisms by which PTMs contribute to protein function is by facilitating interaction with chaperones. Taken together, we propose that XL-MS analysis of chaperone complexes may be used as a unique way to identify biologically-important PTMs on client proteins. In vivo confirmation of Hsp70 dimerization Comprehensive direct interactome of Hsp70 Multi-domain interactions between Hsp70 and client proteins Identification of novel biologically-important client protein PTMs

Microbial cell factories, which convert feedstocks into a product of value, have the potential to help transition toward a bio-based economy with more sustainable ways to produce food, fuels, chemicals, and materials. One common challenge found in most bioconversions is the co-production, together with the product of interest, of undesirable byproducts or overflow metabolites. Here, we designed a strategy based on synthetic microbial communities to address this issue and increase overall production yields. To achieve our goal, we created a Yarrowia lipolytica co-culture comprising a wild-type (WT) strain that consumes glucose to make biomass and citric acid (CA), and an 'upcycler' strain, which consumes the CA produced by the WT strain. The co-culture produced up to two times more β-carotene compared with the WT monoculture using either minimal medium or hydrolysate. The proposed strategy has the potential to be applied to other bioprocesses and organisms.

Abstract Colony growth on solid media is a simple and effective measure for high-throughput genomic experiments such as yeast-two hybrid, Synthetic Genetic Arrays and Synthetic Physical Interaction screens. The development of robotic pinning tools has facilitated the experimental design of these assays, and different imaging software can be used to automatically measure colony sizes on plates. However, comparison to control plates and statistical data analysis is often laborious and pinning issues or plate specific growth effects can lead to the detection of false positive growth defects. We have developed ScreenGarden, a shinyR application, to enable easy, quick and robust data analysis of plate-based high throughput assays.

Abstract Protein phosphorylation regulates multiple cellular processes including cell-cycle progression, which is driven by highly conserved cyclin-dependent kinases (CDKs). CDKs are controlled by the oscillating levels of activating cyclins and the activity peaks during mitosis to promote chromosome segregation. However, with some exceptions, we do not understand how the multitude of CDK-phosphorylated residues within the proteome drive cell-cycle progression nor which CDK phosphorylation events are necessary. To identify yeast proteins whose phospho-regulation is most critical for cell-cycle progression, we created a synthetic CDK complex and systematically recruited this to proteins involved in chromosome segregation using the Synthetic Physical Interactions (SPI) method. We found that targeted recruitment of synthetic CDK to the centromeric protein Mif2 CENP-C leads to enrichment of Mif2 CENP-C at centromeres and arrested cells in late mitosis. We then identified putative CDK consensus sites on Mif2 CENP-C which aid Mif2 CENP-C localisation at centromeres and showed that CDK- dependent Mif2 CENP-C phosphorylation is important for its stable kinetochore localisation. Summary To identify cellular sites of functional cell cycle phospho-regulation we generated a synthetic cyclin-dependent kinase which can be recruited to any given GFP-tagged protein. Using this system with a set of proteins involved in chromosome segregation, we identified Mif2 CENP-C as a kinetochore target of CDK and show that CDK stabilises Mif2’s kinetochore localisation.

Dynamic protein phosphorylation and dephosphorylation play an essential role in cell cycle progression. Kinases and phosphatases are generally highly conserved across eukaryotes, underlining their importance for post-translational regulation of substrate proteins. In recent years, advances in phospho-proteomics have shed light on protein phosphorylation dynamics throughout the cell cycle, and ongoing progress in bioinformatics has significantly improved annotation of specific phosphorylation events to a given kinase. However, the functional impact of individual phosphorylation events on cell cycle progression is often unclear. To address this question, we used the Synthetic Physical Interactions (SPI) method, which enables the systematic recruitment of phospho-regulators to most yeast proteins. Using this method, we identified several putative novel targets involved in chromosome segregation and cytokinesis. The SPI method monitors cell growth and, therefore, serves as a tool to determine the impact of protein phosphorylation on cell cycle progression.

Abstract Background Crocetin is a multifunctional apocarotenoid natural product derived from saffron, holding significant promises for protection against various diseases and other nutritional applications. Historically, crocetin has been extracted from saffron stigmas, but this method is hindered by the limited availability of high-quality raw materials and complex extraction processes. To overcome these challenges, metabolic engineering and synthetic biology can be applied to the sustainable production of crocetin. Results We constructed a Yarrowia lipolytica strain using hybrid promoters and copy number adjustment, which was able to produce 2.66 g/L of β-carotene, the precursor of crocetin. Next, the crocetin biosynthetic pathway was introduced, and we observed both the production and secretion of crocetin. Subsequently, the metabolite profiles under varied temperatures were studied and we found that low temperature was favorable for crocetin biosynthesis in Y. lipolytica . Therefore, a two-step temperature-shift fermentation strategy was adopted to optimize yeast growth and biosynthetic enzyme activity, bringing a 2.3-fold increase in crocetin titer. Lastly, fermentation media was fine-tuned for an optimal crocetin output of 30.17 mg/L, bringing a 51% higher titer compared with the previous highest report in shake flasks. Concomitantly, we also generated Y. lipolytica strains capable of achieving substantial zeaxanthin production, yielding 1575.09 mg/L, doubling the previous highest reported titer. Conclusions Through metabolic engineering and fermentation optimization, we demonstrated the first de novo biosynthesis of crocetin in the industrial yeast Yarrowia lipolytica. In addition, we achieved a higher crocetin titer in flasks than all our known reports. This work not only represents a high production of crocetin, but also entails a significant simultaneous zeaxanthin production, setting the stage for sustainable and cost-effective production of these valuable compounds.

Abstract Most cases of breast cancer (BC) are estrogen receptor α-positive (ERα+) at diagnosis. The presence of ERα drives the therapeutic approach for this disease, which often consists of endocrine therapy (ET). 4OH-Tamoxifen and faslodex ( i.e., fulvestrant - ICI182,780) are two ETs that render tumor cells insensitive to 17β-estradiol (E2)-dependent proliferative stimuli and prevent BC progression. However, ET has limitations and serious failures in different tissues and organs. Thus, there is an urgent need to identify novel drugs to fight BC in the clinic. Re-positioning of old drugs for new clinical purposes is an attractive alternative for drug discovery. For this analysis, we focused on the modulation of intracellular ERα levels in BC cells as target for the screening of about 900 Food and Drug Administration (FDA) approved compounds that would hinder E2:ERα signaling and inhibit BC cell proliferation. We found that carfilzomib induces ERα degradation and prevents E2 signaling and cell proliferation in two ERα+ BC cell lines. Remarkably, the analysis of carfilzomib effects on a cell model system with an acquired resistance to 4OH-tamoxifen revealed that this drug has an antiproliferative effect superior to faslodex in BC cells. Therefore, our results identify carfilzomib as a drug preventing E2:ERα signaling and cell proliferation in BC cells and suggest its possible re-position for the treatment of ERα+ BC as well as for those diseases that have acquired resistance to 4OH-tamoxifen.