ABSTRACT Macrophages are the major host cells of the protozoan parasite Leishmania in mammalian infection. These key innate immune cells display remarkable phenotypic plasticity ranging from pro-inflammatory M1 to anti-inflammatory M2 macrophages that can control infection and tissue homeostasis, respectively. It has been recognized that Leishmania exploits macrophage phenotypic plasticity to establish chronic infection. However, the current notion that these parasites simply trigger an M2-like phenotype seems over-simplified considering the immunopathology observed during leishmaniasis – in particular in response to Leishmania amazonensis - which is often characterized by a mixed Th1/Th2 immune response. Here we combined a series of systems-level analyses to shed new light on the phenotype of Leishmania -infected macrophages (LIMs) during short- and long-term infection, in vitro and in vivo . Immuno-metabolic profiling by RNA-seq, RT-qPCR, cytokine immunoassays, and real-time bioenergetic flux analysis of L. amazonensis -infected bone marrow-derived macrophages (BMDMs) revealed a highly complex and unique phenotypic and bioenergetic signature. In vitro LIMs were characterized by co-expression of both M1 and M2 markers at RNA and protein levels and increased expression of glycolytic genes that matched a progressive metabolic switch from a M2-like respiratory to a M1-like glycolytic energy production observed for both long-term in vitro and in vivo infected macrophages. Unlike in M1 macrophages, glycolytic gene expression did not correlate with increased expression of its key regulatory HIF-1α. In contrast, siRNA knock down experiments in primary BMDMs uncovered an essential role of the m 6 A reader protein IGF2BP2 in stabilizing m 6 A modified transcripts of the glycolytic pathway, contributing to HIF-1α-independent induction of glycolysis. In conclusion, L. amazonensis establishes a complex and unique phenotypic shift in infected macrophages in vitro and in vivo that combines M1-like and M2-like immuno-metabolomic characteristics and implicates differential mRNA stability in induction of aerobic glycolysis. Our data thus uncover epi-transcriptomic regulation as a novel target for Leishmania immune subversion to establish a host cell phenotype beneficial for intracellular parasite development and chronic infection.

Summary Pathogenic protists of the genus Leishmania have evolved various strategies to exploit macrophages as host cells and subvert their immuno-metabolic functions to favour intracellular parasite survival. Surprisingly little is known on how Leishmania affects regulated cell death (RCD) pathways of its host cell, even though increased survival of in vitro infected macrophages has been reported, and chronic macrophage infection in vivo causes the devastating immunopathologies of leishmaniasis. To overcome this limitation and gain first systems-level insight into the interaction between intracellular Leishmania and the host cell RCD pathways, including apoptosis, pyroptosis and necroptosis, we applied transcriptomic analyses on L. amazonensis -infected, primary macrophages (termed LIMs) and used YO-PRO-1 to monitor cell death by fluorescent microscopy. RNAseq analyses at day 3 post-infection (PI) revealed dichotomic dysregulation of more than 60% of RCD-related genes in LIMs, characterized by up-regulation of anti-RCD and down-regulation of pro-RCD markers, including key regulators common to the three forms of cell death such as casp8, fadd, tradd, tnfaip3, tax1bp1, birc3 , and itch . This profile correlated with expression changes of transcription factors known to regulate RCD, including AP1 and NF-κB family members, pparγ and cebpβ . Consequently, LIMs showed remarkable longevity in culture for at least 50 days, despite a constant increase of parasite burden to about 100 parasites per cell, while non-infected cells were cleared from the culture in just a few days. Longitudinal expression analysis of LIMs at days 0, 3, 15, and 30 PI by RT-qPCR confirmed stable maintenance of this high longevity profile with the dichotomic decrease and increase of RCD-activators and -inhibitors, respectively. LIMs further showed significant resistance to RCD-inducing signals compared to non-infected cells, including CSF-1 deprivation (intrinsic apoptosis), actinomycin D treatment (extrinsic apoptosis), LPS/ATP stimulation (pyroptosis). Significantly, we extended the anti-RCD expression pattern and RCD resistance phenotype to L. amazonensis -infected macrophages recovered from lesions, thus validating our long-term in vitro infection system as an easily accessible model to study chronic macrophage infection. In conclusion, our analyses firmly document the pan-anti RCD effect of L. amazonensis on its macrophage host cell in vitro and in vivo and shed important new light on mechanisms underlying Leishmania chronic infection.