Abstract Long noncoding RNAs (lncRNAs) regulate gene expression by association with chromatin, but how they target chromatin remains poorly understood. We have used chromatin RNA immunoprecipitation-coupled high-throughput sequencing to identify 276 lncRNAs enriched in repressive chromatin from breast cancer cells. Using one of the chromatin-interacting lncRNAs, MEG3 , we explore the mechanisms by which lncRNAs target chromatin. Here we show that MEG3 and EZH2 share common target genes, including the TGF-β pathway genes. Genome-wide mapping of MEG3 binding sites reveals that MEG3 modulates the activity of TGF-β genes by binding to distal regulatory elements. MEG3 binding sites have GA-rich sequences, which guide MEG3 to the chromatin through RNA–DNA triplex formation. We have found that RNA–DNA triplex structures are widespread and are present over the MEG3 binding sites associated with the TGF-β pathway genes. Our findings suggest that RNA–DNA triplex formation could be a general characteristic of target gene recognition by the chromatin-interacting lncRNAs.

ABSTRACT The relationship between the 3D organisation of chromatin inside the nucleus and the regulation of gene expression remains unclear. While disruption of domains and domain boundaries can lead to mis-expression of developmental genes, acute depletion of key regulators of genome organisation, such as CTCF and cohesin, and major reorganisation of genomic regions have relatively small effects on gene expression. Therefore, it is unclear whether changes in gene expression and chromatin state drive chromatin reorganisation, or whether changes in chromatin organisation facilitate cell type-specific activation of genes and their regulatory elements. Here, using the Drosophila melanogaster dorsoventral patterning system as a model, we demonstrate the independence of 3D chromatin organisation and developmental gene regulation. We define tissue-specific enhancers and link them to expression patterns at the single-cell level using single cell RNA-seq. Surprisingly, despite tissue-specific differences in chromatin state and gene expression, 3D chromatin organisation is maintained across tissues. Our results provide strong evidence that tissue-specific chromatin conformation is not required for tissue-specific gene expression, but rather acts as an architectural framework to facilitate proper gene regulation during development.

Abstract Formation of tissue-specific transcriptional programs underlies multicellular development, but how the chromatin landscape influences transcription is not fully understood. Here we comprehensively resolve differential transcriptional and chromatin states during Drosophila dorsoventral (DV) patterning. We find that RNA Polymerase II pausing is established at DV promoters prior to zygotic genome activation (ZGA), that pausing persists irrespective of cell fate, but that release into productive elongation is tightly regulated and accompanied by tissue-specific P-TEFb recruitment. DV enhancers acquire distinct tissue-specific chromatin states through CBP-mediated histone acetylation that predict the transcriptional output of target genes, whereas promoter states are more tissue invariant. Transcriptome-wide inference of burst kinetics in different cell types revealed that while DV genes are generally characterized by a high burst size, either burst size or frequency can differ between tissues. The data suggest that pausing is established by pioneer transcription factors prior to ZGA and that release from pausing is imparted by enhancer chromatin state to regulate bursting in a tissue-specific manner in the early embryo. Our results uncover how developmental patterning is orchestrated by tissue-specific bursts of transcription from Pol II primed promoters in response to enhancer regulatory cues.

Abstract Telomerase-negative tumors maintain telomere length by alternative lengthening of telomeres (ALT), but the underlying mechanism behind ALT remains poorly understood. A proportion of aggressive neuroblastoma (NB), particularly relapsed tumors, are positive for ALT (ALT+), suggesting that a better dissection of the ALT mechanism could lead to novel therapeutic opportunities. TERRA, a long non-coding RNA (lncRNA) derived from telomere ends, localizes to telomeres in a R-loop-dependent manner and plays a crucial role in telomere maintenance. Here we present evidence that RNA modification at the N 6 position of internal adenosine (m 6 A) in TERRA by the methyltransferase METTL3 is essential for telomere maintenance in ALT+ cells, and the loss of TERRA m 6 A/METTL3 results in telomere damage. We observed that m 6 A modification is abundant in R-loop enriched TERRA, and the m 6 A-mediated recruitment of hnRNPA2B1 to TERRA is critical for R-loop formation. Our findings suggest that m 6 A drives telomere targeting of TERRA via R-loops, and this m 6 A-mediated R-loop formation could be a widespread mechanism employed by other chromatin-interacting lncRNAs. Furthermore, treatment of ALT+ NB cells with a METTL3 inhibitor resulted in compromised telomere targeting of TERRA and accumulation of DNA damage at telomeres, indicating that METTL3 inhibition may represent a therapeutic approach for ALT+ NB.

ABSTRACT Host-viral interactions during SARS-CoV-2 infection are needed to understand COVID-19 pathogenesis and may help to guide the design of novel antiviral therapeutics. N 6 -methyladenosine modification (m 6 A), one of the most abundant cellular RNA modifications, regulates key processes in RNA metabolism during a stress response. Gene expression profiles observed post-infection with different SARS-CoV-2 variants show changes in the expression of genes related to RNA catabolism, including m 6 A readers and erasers. We found that infection with SARS-CoV-2 variants caused a loss of m 6 A in cellular RNAs, whereas m 6 A was detected abundantly in viral RNA. METTL3, the m 6 A methyltransferase, showed an unusual cytoplasmic localization post-infection. The B.1.351 variant had a less pronounced effect on METTL3 localization and loss of m 6 A than the B.1 and B.1.1.7 variants. We also observed a loss of m 6 A upon SARS-CoV-2 infection in air/liquid interface cultures of human airway epithelia, confirming that m 6 A loss is characteristic of SARS-CoV-2 infected cells. Further, transcripts with m 6 A modification were preferentially down-regulated post-infection. Inhibition of the export protein XPO1 resulted in the restoration of METTL3 localization, recovery of m 6 A on cellular RNA, and increased mRNA expression. Stress granule formation, which was compromised by SARS-CoV-2 infection, was restored by XPO1 inhibition and accompanied by a reduced viral infection in vitro . Together, our study elucidates how SARS-CoV-2 inhibits the stress response and perturbs cellular gene expression in an m 6 A-dependent manner.

Abstract Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial childhood cancer, caused by the improper differentiation of developing trunk neural crest cells (tNCC) in the sympathetic nervous system. The N 6 -methyladenosine (m 6 A) epitranscriptomic modification controls post-transcriptional gene expression but the mechanism by which the m 6 A methyltransferase complex METTL3/METTL14/WTAP is recruited to specific loci remains to be fully characterized. We explored whether the m 6 A epitranscriptome could fine-tune gene regulation in migrating/differentiating tNCC. We demonstrate that the m 6 A modification regulates the expression of HOX genes in tNCC, thereby contributing to their timely differentiation into sympathetic neurons. Furthermore, we show that posterior HOX genes are m 6 A modified in MYCN-amplified NB with reduced expression. In addition, we provide evidence that sustained overexpression of the MYCN oncogene in tNCC drives METTL3 recruitment to a specific subset of genes including posterior HOX genes creating an undifferentiated state. Moreover, METTL3 depletion/inhibition induces DNA damage and differentiation of MYCN overexpressing cells and increases vulnerability to chemotherapeutic drugs in MYCN-amplified patient-derived xenografts (PDX) cells, suggesting METTL3 inhibition could be a potential therapeutic approach for NB.