Abstract Background The control of plant anthocyanin accumulation is via transcriptional regulation of the genes encoding the biosynthetic enzymes. A key activator appears to be an R2R3 MYB transcription factor. In apple fruit, skin anthocyanin levels are controlled by a gene called MYBA or MYB1 , while the gene determining fruit flesh and foliage anthocyanin has been termed MYB10 . In order to further understand tissue-specific anthocyanin regulation we have isolated orthologous MYB genes from all the commercially important rosaceous species. Results We use gene specific primers to show that the three MYB activators of apple anthocyanin ( MYB10/MYB1/MYBA) are likely alleles of each other. MYB transcription factors, with high sequence identity to the apple gene were isolated from across the rosaceous family (e.g. apples, pears, plums, cherries, peaches, raspberries, rose, strawberry). Key identifying amino acid residues were found in both the DNA-binding and C-terminal domains of these MYBs. The expression of these MYB10 genes correlates with fruit and flower anthocyanin levels. Their function was tested in tobacco and strawberry. In tobacco, these MYBs were shown to induce the anthocyanin pathway when co-expressed with bHLHs, while over-expression of strawberry and apple genes in the crop of origin elevates anthocyanins. Conclusions This family-wide study of rosaceous R2R3 MYBs provides insight into the evolution of this plant trait. It has implications for the development of new coloured fruit and flowers, as well as aiding the understanding of temporal-spatial colour change.

Summary Anthocyanin pigmentation is an important consumer trait in peach ( Prunus persica ). In this study, the genetic basis of the blood‐flesh trait was investigated using the cultivar Dahongpao, which shows high levels of cyanidin‐3‐glucoside in the mesocarp. Elevation of anthocyanin levels in the flesh was correlated with the expression of an R2R3 MYB transcription factor, Pp MYB 10.1 . However, Pp MYB 10.1 did not co‐segregate with the blood‐flesh trait. The blood‐flesh trait was mapped to a 200‐kb interval on peach linkage group ( LG ) 5. Within this interval, a gene encoding a NAC domain transcription factor ( TF ) was found to be highly up‐regulated in blood‐fleshed peaches when compared with non‐red‐fleshed peaches. This NAC TF , designated BLOOD ( BL ), acts as a heterodimer with Pp NAC 1 which shows high levels of expression in fruit at late developmental stages. We show that the heterodimer of BL and Pp NAC 1 can activate the transcription of Pp MYB 10.1 , resulting in anthocyanin pigmentation in tobacco. Furthermore, silencing the BL gene reduces anthocyanin pigmentation in blood‐fleshed peaches. The transactivation activity of the BL ‐Pp NAC 1 heterodimer is repressed by a SQUAMOSA promoter‐binding protein‐like TF , Pp SPL 1. Low levels of Pp MYB 10.1 expression in fruit at early developmental stages is probably attributable to lower levels of expression of Pp NAC 1 plus the presence of high levels of repressors such as Pp SPL 1. We present a mechanism whereby BL is the key gene for the blood‐flesh trait in peach via its activation of Pp MYB 10.1 in maturing fruit. Partner TF s such as basic helix–loop‐helix proteins and NAC 1 are required, as is the removal of transcriptional repressors.

Abstract Anthocyanin accumulation is coordinated in plants by a number of conserved transcription factors. In apple (Malus × domestica), an R2R3 MYB transcription factor has been shown to control fruit flesh and foliage anthocyanin pigmentation (MYB10) and fruit skin color (MYB1). However, the pattern of expression and allelic variation at these loci does not explain all anthocyanin-related apple phenotypes. One such example is an open-pollinated seedling of cv Sangrado that has green foliage and develops red flesh in the fruit cortex late in maturity. We used methods that combine plant breeding, molecular biology, and genomics to identify duplicated MYB transcription factors that could control this phenotype. We then demonstrated that the red-flesh cortex phenotype is associated with enhanced expression of MYB110a, a paralog of MYB10. Functional characterization of MYB110a showed that it was able to up-regulate anthocyanin biosynthesis in tobacco (Nicotiana tabacum). The chromosomal location of MYB110a is consistent with a whole-genome duplication event that occurred during the evolution of apple within the Maloideae family. Both MYB10 and MYB110a have conserved function in some cultivars, but they differ in their expression pattern and response to fruit maturity.

Some apple (Malus × domestica Borkh.) varieties have attractive striping patterns, a quality attribute that is important for determining apple fruit market acceptance. Most apple cultivars (e.g. 'Royal Gala') produce fruit with a defined fruit pigment pattern, but in the case of 'Honeycrisp' apple, trees can produce fruits of two different kinds: striped and blushed. The causes of this phenomenon are unknown. Here we show that striped areas of 'Honeycrisp' and 'Royal Gala' are due to sectorial increases in anthocyanin concentration. Transcript levels of the major biosynthetic genes and MYB10, a transcription factor that upregulates apple anthocyanin production, correlated with increased anthocyanin concentration in stripes. However, nucleotide changes in the promoter and coding sequence of MYB10 do not correlate with skin pattern in 'Honeycrisp' and other cultivars differing in peel pigmentation patterns. A survey of methylation levels throughout the coding region of MYB10 and a 2.5 Kb region 5' of the ATG translation start site indicated that an area 900 bp long, starting 1400 bp upstream of the translation start site, is highly methylated. Cytosine methylation was present in all three contexts, with higher methylation levels observed for CHH and CHG (where H is A, C or T) than for CG. Comparisons of methylation levels of the MYB10 promoter in 'Honeycrisp' red and green stripes indicated that they correlate with peel phenotypes, with an enrichment of methylation observed in green stripes. Differences in anthocyanin levels between red and green stripes can be explained by differential transcript accumulation of MYB10. Different levels of MYB10 transcript in red versus green stripes are inversely associated with methylation levels in the promoter region. Although observed methylation differences are modest, trends are consistent across years and differences are statistically significant. Methylation may be associated with the presence of a TRIM retrotransposon within the promoter region, but the presence of the TRIM element alone cannot explain the phenotypic variability observed in 'Honeycrisp'. We suggest that methylation in the MYB10 promoter is more variable in 'Honeycrisp' than in 'Royal Gala', leading to more variable color patterns in the peel of this cultivar.

Summary Anthocyanin and proanthocyanidin ( PA ) accumulation is regulated by both myeloblastosis ( MYB ) activators and repressors, but little information is available on hierarchical interactions between the positive and negative regulators. Here, we report on a R2R3‐ MYB repressor in peach, designated Pp MYB 18, which acts as a negative regulator of anthocyanin and PA accumulation. Pp MYB 18 can be activated by both anthocyanin‐ and PA ‐related MYB activators, and is expressed both at fruit ripening and juvenile stages when anthocyanins or PAs, respectively, are being synthesized. The Pp MYB 18 protein competes with MYB activators for binding to basic Helix Loop Helixes ( bHLH s), which develops a fine‐tuning regulatory loop to balance PA and anthocyanin accumulation. In addition, the bHLH binding motif in the R3 domain and the C1 and C2 repression motifs in the C‐terminus of Pp MYB 18 both confer repressive activity of Pp MYB 18. Our study also demonstrates a modifying negative feedback loop, which prevents cells from excess accumulation of anthocyanin and PA s, and serves as a model for balancing secondary metabolite accumulation at the transcriptional level.

Abstract Chinese plum ( Prunus salicina Lindl.) is a stone fruit that belongs to the Prunus genus and plays an important role in the global production of plum. In this study, we report the genome sequence of the Chinese plum ‘Sanyueli’, which is known to have a low-chill requirement for flower bud break. The assembled genome size was 308.06 Mb, with a contig N50 of 815.7 kb. A total of 30,159 protein-coding genes were predicted from the genome and 56.4% (173.39 Mb) of the genome was annotated as repetitive sequence. Bud dormancy is influenced by chilling requirement in plum and partly controlled by DORMANCY ASSOCIATED MADS-box ( DAM ) genes. Six tandemly arrayed PsDAM genes were identified in the assembled genome. Sequence analysis of PsDAM6 in ‘Sanyueli’revealed the presence of large insertions in the intron and exon regions. Transcriptome analysis indicated that the expression of PsDAM6 in the dormant flower buds of ‘Sanyueli’ was significantly lower than that in the dormant flower buds of the high chill requiring ‘Furongli’ plum. In addition, the expression of PsDAM6 was repressed by chilling treatment. The genome sequence of ‘Sanyueli’ plum provides a valuable resource for elucidating the molecular mechanisms responsible for the regulation of chilling requirements, and is also useful for the identification of the genes involved in the control of other important agronomic traits and molecular breeding in plum.

Abstract Peach varieties that differ in red coloration due to varied anthocyanin accumulation result from transcriptional regulation by PpMYB10s , a group of specific R2R3 MYBs. Here we investigated the mechanisms driving a lack of anthocyanin in yellow‐skinned ‘Jinxiu’ peach peel, as well as accumulation induced by UV irradiance. It was found that PpMYB10.1 , PpMYB10.2 and PpMYB10.3 were positive regulators of anthocyanin accumulation, but the stimulation by PpMYB10.2 was weak. Low expression of PpMYB10.1 causes natural anthocyanin deficiency in ‘Jinxiu’ peel. However, the promoter sequences of PpMYB10.1 were identical in ‘Jinxiu’ and a naturally red‐coloured peach ‘Hujingmilu’. Therefore, potential negative regulator(s) upstream of PpMYB10.1 were explored. A novel R2R3‐MYB repressor termed PpMYB80 was identified through comparative transcriptomic analysis and then functionally confirmed via transiently overexpressing and silencing in peach fruit, as well as transformation in tobacco. PpMYB80 directly binds to the promoter of PpMYB10.1 and inhibits its expression, but does not affect PpMYB10.3 . In UV‐exposed ‘Jinxiu’ fruit, expression of PpMYB10.3 was upregulated, while PpMYB10.1 remained low and PpMYB80 enhanced, which results in accumulation of anthocyanin in peel. This study revealed a transcriptional cascade involving PpMYB activators and repressors in regulating basal and UV‐induced anthocyanin accumulation in peach peel.