Natural killer T (NKT) cells recognize glycolipid antigens presented by the MHC class I–related glycoprotein CD1d. The in vivo dynamics of the NKT cell population in response to glycolipid activation remain poorly understood. Here, we show that a single administration of the synthetic glycolipid α-galactosylceramide (α-GalCer) induces long-term NKT cell unresponsiveness in mice. NKT cells failed to proliferate and produce IFN-γ upon α-GalCer restimulation but retained the capacity to produce IL-4. Consequently, we found that activation of anergic NKT cells with α-GalCer exacerbated, rather than prevented, B16 metastasis formation, but that these cells retained their capacity to protect mice against experimental autoimmune encephalomyelitis. NKT cell anergy was induced in a thymus-independent manner and maintained in an NKT cell–autonomous manner. The anergic state could be broken by IL-2 and by stimuli that bypass proximal TCR signaling events. Collectively, the kinetics of initial NKT cell activation, expansion, and induction of anergy in response to α-GalCer administration resemble the responses of conventional T cells to strong stimuli such as superantigens. Our findings have important implications for the development of NKT cell–based vaccines and immunotherapies.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) serves as a prototypic model for T cell–mediated autoimmunity. Vα14 natural killer T (NKT) cells are a subset of T lymphocytes that recognize glycolipid antigens presented by the nonpolymorphic major histocompatibility complex (MHC) class I–like protein CD1d. Here, we show that activation of Vα14 NKT cells by the glycosphingolipid α-galactosylceramide (α-GalCer) protects susceptible mice against EAE. β-GalCer, which binds CD1d but is not recognized by NKT cells, failed to protect mice against EAE. Furthermore, α-GalCer was unable to protect CD1d knockout (KO) mice against EAE, indicating the requirement for an intact CD1d antigen presentation pathway. Protection of disease conferred by α-GalCer correlated with its ability to suppress myelin antigen-specific Th1 responses and/or to promote myelin antigen-specific Th2 cell responses. α-GalCer was unable to protect IL-4 KO and IL-10 KO mice against EAE, indicating a critical role for both of these cytokines. Because recognition of α-GalCer by NKT cells is phylogenetically conserved, our findings have identified NKT cells as novel target cells for treatment of inflammatory diseases of the central nervous system.

CD4+ T cells play a critical role in regulating autoimmune diseases, and intestinal microbial metabolites control various immune responses. Granzyme B (GzmB)-producing CD4+ T cells have been recently reported to participate in the pathogenesis of autoimmune diseases. Here, we found that GzmbB-deficient CD4+ T cells induced more severe colitis in Rag1−/− mice than wild-type (WT) CD4+ T cells. Germ-free (GF) mice exhibited a lower expression of GzmB in intestinal CD4+ T cells compared to specific pathogen-free (SPF) mice. Intestinal microbial metabolite butyrate increased GzmB expression in CD4+ T cells, especially in IL-10-producing Th1 cells, through HDAC inhibition and GPR43, but not GPR41 and GPR109a. Butyrate-treated GzmB-deficient CD4+ T cells demonstrated more severe colitis compared to butyrate-treated WT CD4+ T cells in the T cell transfer model. Butyrate altered intestinal microbiota composition, but altered microbiota did not mediate butyrate induction of intestinal CD4+ T cell expression of GzmB in mice. Blimp1 was involved in the butyrate induction of GzmB in IL-10-producing Th1 cells. Glucose metabolism, including glycolysis and pyruvate oxidation, mediated butyrate induction of GzmB in Th1 cells. In addition, we found that IKZF3 and NR2F6 regulated GzmB expression induced by butyrate. Together, our studies underscored the critical role of GzmB in mediating gut bacterial metabolite butyrate regulation of T cell tolerance at the mucosal surface.

Innate CD8alphaalpha+ cells, also referred to as iCD8alpha cells, are TCR-negative intraepithelial lymphocytes (IEL) possessing cytokine and chemokine profiles and functions related to innate immune cells. iCD8alpha cells constitute an important source of osteopontin in the intestinal epithelium. Osteopontin is a pleiotropic cytokine with diverse roles in bone and tissue remodeling, but also has relevant functions in the homeostasis of immune cells. In this report, we present evidence for the role of iCD8alpha cells and osteopontin in the homeostasis of TCR-negative NKp46+NK1.1+ IEL (ILC1-like). We show that in the absence of iCD8alpha cells, the number of NKp46+NK1.1+ IEL is significantly reduced. These ILC1-like cells are involved in intestinal pathogenesis in the anti-CD40 mouse model of intestinal inflammation. Reduced iCD8alpha cell numbers and/or osteopontin expression results in a milder form of intestinal inflammation in this disease model. Collectively, our results suggest that iCD8alpha cells and osteopontin promote survival of NKp46+NK1.1+ IEL, which significantly impacts the development of intestinal inflammation.

Intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL) comprise a diverse population of cells residing in the epithelium at the interface between the intestinal lumen and the sterile environment of the lamina propria. Because of this anatomical location, IEL are considered critical components of intestinal immune responses. Indeed, IEL are involved in many different immunological processes ranging from pathogen control to tissue stability. However, despite their critical importance in mucosal immune responses, very little is known about the homeostasis of different IEL subpopulations. The phosphoprotein osteopontin is important for critical physiological processes, including cellular immune responses such as survival of Th17 cells and homeostasis of NK cells, among others. Because of its impact in the immune system, we investigated the role of osteopontin in the homeostasis of IEL. Here, we report that mice deficient in the expression of osteopontin exhibit reduced numbers of the IEL subpopulations TCRγδ+, TCRβ+CD4+, TCRβ+CD4+CD8α+ and TCRβ+CD8αα+ cells in comparison to wild-type mice. For some IEL subpopulations the decrease in cells numbers could be attributed to apoptosis and reduced cell division. Moreover, we show in vitro that exogenous osteopontin stimulates the survival of murine IEL subpopulations and unfractionated IEL derived from human intestines, an effect mediated by CD44, a known osteopontin receptor. We also show that iCD8α IEL, but not TCRγδ+ IEL, TCRβ+ IEL or intestinal epithelial cells, can promote survival of different IEL populations via osteopontin, indicating an important role for iCD8α cells in the homeostasis of IEL.Key Points 1. Osteopontin promotes homeostasis of mouse and human IEL, mediated by its ligand CD442. iCD8α cells produce osteopontin which impacts the survival of other IEL3. Lack of osteopontin renders mice susceptible to intestinal inflammation

One of the major contributors to child mortality in the world is diarrheal diseases, with an estimated 800,000 deaths per year. Many pathogens are causative agents of these illnesses, including the enteropathogenic (EPEC) or enterohemorrhagic (EHEC) forms of Escherichia coli. These bacteria are characterized by their ability to cause attaching and effacing lesions in the gut mucosa. Although much has been learned about the pathogenicity of these organisms and the immune response against them, the role of the intestinal microbiota during these infections is not well characterized. Infection of mice with E. coli requires pre-treatment with antibiotics in most mouse models, which hinders the study of the microbiota in an undisturbed environment. Using Citrobacter rodentium as a murine model for attaching and effacing bacteria, we show that C57BL/6 mice deficient in granzyme B expression are highly susceptible to severe disease caused by C. rodentium infection. Although a previous publication from our group shows that granzyme B-deficient CD4+ T cells are partially responsible for this phenotype, in this report we present data demonstrating that the microbiota, in particular members of the order Turicibacterales, have an important role in conferring resistance. Mice deficient in Turicibacter sanguinis have increased susceptibility to severe disease. However, when these mice are co-housed with resistant mice, or colonized with T. sanguinis, susceptibility to severe infection is reduced. These results clearly suggest a critical role for this commensal in the protection against entero-pathogens.

Abstract Background Osteopontin (OPN) is an important breastmilk protein involved in infant intestinal, immunological, and brain development. However, little is known about how common milk pasteurization and storage techniques affect this important bioactive protein. Methods Human milk osteopontin concentration was measured in single-donor fresh or frozen breastmilk, pooled Holder-pasteurized donor breastmilk, and a shelf-stable (retort pasteurized) breastmilk product by ELISA. Breastmilk samples were pasteurized and/or frozen before measuring osteopontin concentrations. Results Holder pasteurization of breastmilk resulted in an ∼50% decrease in osteopontin levels within single-donor samples, whereas pooled donor breastmilk had comparable osteopontin levels to non-pasteurized single-donor samples. Breastmilk from mothers of preterm infants trended toward higher osteopontin concentration than mothers of term infants; however, samples from preterm mothers experienced greater osteopontin degradation upon pasteurization. Finally, freezing breastmilk prior to Holder pasteurization resulted in less osteopontin degradation than Holder pasteurization prior to freezing. Conclusion Commonly used breastmilk pasteurization and storage techniques, including freezing, Holder and retort pasteurization, decrease the levels of the bioactive protein osteopontin in human breastmilk. Impact Pasteurization of human breastmilk significantly decreases the levels of the bioactive protein osteopontin Use of both pasteurization and freezing techniques for breastmilk preservation results in greater loss of osteopontin This study presents for the first time an analysis of osteopontin levels in single-donor pasteurized milk samples

Abstract CD4 + T cell activation and differentiation are important events that set the stage for proper immune responses. Many factors are involved in the activation and differentiation of T cells, and these events are tightly controlled to prevent unwanted and/or exacerbated immune responses that may harm the host. It has been well documented that granzyme B, a potent serine protease involved in cell-mediated cytotoxicity, is readily expressed by certain CD4 + T cells, such as regulatory T cells and CD4 + CD8αα + intestinal intraepithelial lymphocytes, both of which display cytotoxicity associated with granzyme B. However, because not all CD4 + T cells expressing granzyme B are cytotoxic, additional roles for this protease in CD4 + T cell biology remain unknown. Here, using a combination of in vivo and in vitro approaches, we report that granzyme B-deficient CD4 + T cells display increased IL-17 production. In the adoptive transfer model of intestinal inflammation, granzyme B-deficient CD4 + T cells triggered a more rapid disease onset than their WT counterparts, and presented a differential transcription profile. Similar results were also observed in granzyme B-deficient mice infected with Citrobacter rodentium . Our results suggest that granzyme B modulates CD4 + T cell differentiation, providing a new perspective into the biology of this enzyme.