Epigenetic Brainscape Epigenetic modifications and their potential changes during development are of high interest, but few studies have characterized such differences. Lister et al. ( 1237905 , published online 4 July; see the Perspective by Gabel and Greenberg ) report whole-genome base-resolution analysis of DNA cytosine modifications and transcriptome analysis in the frontal cortex of human and mouse brains at multiple developmental stages. The high-resolution mapping of DNA cytosine methylation (5mC) and one of its oxidation derivatives (5hmC) at key developmental stages provides a comprehensive resource covering the temporal dynamics of these epigenetic modifications in neurons compared to glia. The data suggest that methylation marks are dynamic during brain development in both humans and mice.

Enzymes of the TET family convert 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) in DNA. Mutations in the gene encoding TET2 are common in myeloid malignancies. These disease-associated mutations are now shown to compromise TET2 catalytic activity: bone-marrow samples from patients with TET2 mutations have low levels of 5-hmC in genomic DNA, and TET2 is required for normal haematopoietic differentiation. Measurement of genomic 5-hmC levels may prove valuable as a diagnostic tool in myeloid cancers. The TET family of enzymes convert 5-methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in DNA. Mutations in the gene encoding TET2 are frequently observed in myeloid malignancies. Here it is shown that these disease-associated mutations compromise TET2 catalytic activity; bone marrow samples from patients with TET2 mutations have low levels of 5hmC in genomic DNA, and TET2 is required for normal haematopoietic differentiation. Measurement of genomic 5hmC levels may prove valuable as a diagnostic tool in myeloid cancers. TET2 is a close relative of TET1, an enzyme that converts 5-methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in DNA1,2. The gene encoding TET2 resides at chromosome 4q24, in a region showing recurrent microdeletions and copy-neutral loss of heterozygosity (CN-LOH) in patients with diverse myeloid malignancies3. Somatic TET2 mutations are frequently observed in myelodysplastic syndromes (MDS), myeloproliferative neoplasms (MPN), MDS/MPN overlap syndromes including chronic myelomonocytic leukaemia (CMML), acute myeloid leukaemias (AML) and secondary AML (sAML)4,5,6,7,8,9,10,11,12. We show here that TET2 mutations associated with myeloid malignancies compromise catalytic activity. Bone marrow samples from patients with TET2 mutations displayed uniformly low levels of 5hmC in genomic DNA compared to bone marrow samples from healthy controls. Moreover, small hairpin RNA (shRNA)-mediated depletion of Tet2 in mouse haematopoietic precursors skewed their differentiation towards monocyte/macrophage lineages in culture. There was no significant difference in DNA methylation between bone marrow samples from patients with high 5hmC versus healthy controls, but samples from patients with low 5hmC showed hypomethylation relative to controls at the majority of differentially methylated CpG sites. Our results demonstrate that Tet2 is important for normal myelopoiesis, and suggest that disruption of TET2 enzymatic activity favours myeloid tumorigenesis. Measurement of 5hmC levels in myeloid malignancies may prove valuable as a diagnostic and prognostic tool, to tailor therapies and assess responses to anticancer drugs.

The modified DNA base 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), sometimes called the sixth base, is present in the mammalian genome where it is generated by oxidation of 5-methylcytosine (5mC; the fifth base) by enzymes of the Tet family. Four papers in this issue, from the Helin, Zhang, Rao and Reik laboratories, respectively, report on the genome-wide distribution of Tet1 and/or 5hmC in mouse embryonic stem cells using the ChIP-seq technique. Links between Tet1 and transcription regulation — both activation and repression — are revealed. Anjana Rao and colleagues also describe two alternative methods with increased sensitivity for mapping single 5hmC bases. In the associated News & Views, Nathalie Véron and Antoine H. F. M. Peters discuss what these and other recent papers reveal about the role of Tet proteins in regulating DNA methylation and gene expression. 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) is a modified base present at low levels in diverse cell types in mammals1,2,3,4,5. 5hmC is generated by the TET family of Fe(II) and 2-oxoglutarate-dependent enzymes through oxidation of 5-methylcytosine (5mC)1,2,4,5,6,7. 5hmC and TET proteins have been implicated in stem cell biology and cancer1,4,5,8,9, but information on the genome-wide distribution of 5hmC is limited. Here we describe two novel and specific approaches to profile the genomic localization of 5hmC. The first approach, termed GLIB (glucosylation, periodate oxidation, biotinylation) uses a combination of enzymatic and chemical steps to isolate DNA fragments containing as few as a single 5hmC. The second approach involves conversion of 5hmC to cytosine 5-methylenesulphonate (CMS) by treatment of genomic DNA with sodium bisulphite, followed by immunoprecipitation of CMS-containing DNA with a specific antiserum to CMS5. High-throughput sequencing of 5hmC-containing DNA from mouse embryonic stem (ES) cells showed strong enrichment within exons and near transcriptional start sites. 5hmC was especially enriched at the start sites of genes whose promoters bear dual histone 3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3) and histone 3 lysine 4 trimethylation (H3K4me3) marks. Our results indicate that 5hmC has a probable role in transcriptional regulation, and suggest a model in which 5hmC contributes to the ‘poised’ chromatin signature found at developmentally-regulated genes in ES cells.

TET family enzymes convert 5-methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in DNA. Here, we show that Tet1 and Tet2 are Oct4-regulated enzymes that together sustain 5hmC in mouse embryonic stem cells (ESCs) and are induced concomitantly with 5hmC during reprogramming of fibroblasts to induced pluripotent stem cells. ESCs depleted of Tet1 by RNAi show diminished expression of the Nodal antagonist Lefty1 and display hyperactive Nodal signaling and skewed differentiation into the endoderm-mesoderm lineage in embryoid bodies in vitro. In Fgf4- and heparin-supplemented culture conditions, Tet1-depleted ESCs activate the trophoblast stem cell lineage determinant Elf5 and can colonize the placenta in midgestation embryo chimeras. Consistent with these findings, Tet1-depleted ESCs form aggressive hemorrhagic teratomas with increased endoderm, reduced neuroectoderm, and ectopic appearance of trophoblastic giant cells. Thus, 5hmC is an epigenetic modification associated with the pluripotent state, and Tet1 functions to regulate the lineage differentiation potential of ESCs.

Background We recently showed that enzymes of the TET family convert 5-mC to 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) in DNA. 5-hmC is present at high levels in embryonic stem cells and Purkinje neurons. The methylation status of cytosines is typically assessed by reaction with sodium bisulfite followed by PCR amplification. Reaction with sodium bisulfite promotes cytosine deamination, whereas 5-methylcytosine (5-mC) reacts poorly with bisulfite and is resistant to deamination. Since 5-hmC reacts with bisulfite to yield cytosine 5-methylenesulfonate (CMS), we asked how DNA containing 5-hmC behaves in bisulfite sequencing. Methodology/Principal Findings We used synthetic oligonucleotides with different distributions of cytosine as templates for generation of DNAs containing C, 5-mC and 5-hmC. The resulting DNAs were subjected in parallel to bisulfite treatment, followed by exposure to conditions promoting cytosine deamination. The extent of conversion of 5-hmC to CMS was estimated to be 99.7%. Sequencing of PCR products showed that neither 5-mC nor 5-hmC undergo C-to-T transitions after bisulfite treatment, confirming that these two modified cytosine species are indistinguishable by the bisulfite technique. DNA in which CMS constituted a large fraction of all bases (28/201) was much less efficiently amplified than DNA in which those bases were 5-mC or uracil (the latter produced by cytosine deamination). Using a series of primer extension experiments, we traced the inefficient amplification of CMS-containing DNA to stalling of Taq polymerase at sites of CMS modification, especially when two CMS bases were either adjacent to one another or separated by 1–2 nucleotides. Conclusions We have confirmed that the widely used bisulfite sequencing technique does not distinguish between 5-mC and 5-hmC. Moreover, we show that CMS, the product of bisulfite conversion of 5-hmC, tends to stall DNA polymerases during PCR, suggesting that densely hydroxymethylated regions of DNA may be underrepresented in quantitative methylation analyses.

Abstract Existing knowledge of the role of epigenetic modifiers in pancreas development has exponentially increased. However, the function of TET dioxygenases in pancreatic endocrine specification remains obscure. We set out to tackle this issue using a human embryonic stem cell (hESC) differentiation system, in which TET1 / TET2 / TET3 triple knock-out cells display severe defects in pancreatic β-cell specification. Integrative whole-genome analysis identifies unique cell-type-specific hypermethylated regions (hyper-DMRs) displaying reduced chromatin activity and remarkable enrichment of FOXA2, a pioneer transcription factor essential for pancreatic endoderm specification. Intriguingly, TET depletion leads to significant changes in FOXA2 binding at pancreatic progenitor stage, in which gene loci with decreased FOXA2 binding features low levels of active chromatin modifications and enriches for bHLH motifs. Transduction of full-length TET1 but not the TET1-catalytic-domain in TET -deficient cells effectively rescues β-cell differentiation accompanied by restoring PAX4 hypomethylation. Taking these findings together with the defective generation of functional β-cells upon TET1-inactivation, our study unveils an essential role of TET1-dependent demethylation in establishing β-cell identity. Moreover, we discover a physical interaction between TET1 and FOXA2 in endodermal lineage intermediates, which provides a new mechanistic clue regarding the complex crosstalk between TET dioxygenases and pioneer transcription factors in epigenetic regulation during pancreas specification.

ABSTRACT As two prominent examples of intracellular single-domain antibodies or antibody mimetics derived from synthetic protein scaffolds, monobodies and nanobodies are gaining wide applications in cell biology, structural biology, synthetic immunology, and theranostics. We introduce herein a generally-applicable method to engineer light-controllable monobodies and nanobodies, designated as moonbody and sunbody, respectively. These engineered antibody-like modular domains enable rapid and reversible antibody-antigen recognition by utilizing light. By paralleled insertion of two LOV2 modules into a single sunbody and the use of bivalent sunbodies, we substantially enhance the range of dynamic changes of photo-switchable sunbodies. Furthermore, we demonstrate the use of moonbodies or sunbodies to precisely control protein degradation, gene transcription, and base editing by harnessing the power of light.

Abstract The cell-free DNA (cfDNA) methylation profile in liquid biopsies has been utilized to diagnose early-stage disease and estimate therapy response. However, in typical clinical settings, only very small amounts of cfDNA can be purified. Whole-genome bisulfite sequencing (WGBS) is the gold standard to measure DNA methylation; however, WGBS using small amounts of fragmented DNA introduces a critical challenge for data analysis, namely a low mapping ratio. This, in turn, generates low sequencing depth and low coverage for CpG sites genome wide. The lack of informative CpGs has become a bottleneck for the clinical application of cfDNA-based WGBS assays. Hence, we developed LiBis (Low-input Bisulfite Sequencing), a novel method for low-input WGBS data alignment. By dynamically clipping initially unmapped reads and remapping clipped fragments, we judiciously rescued those reads and uniquely aligned them to the genome. By substantially increasing the mapping ratio by up to 88%, LiBis dramatically improved the number of informative CpGs and the precision in quantifying the methylation status of individual CpG sites. The high sensitivity and cost effectiveness afforded by LiBis for low-input samples will allow the discovery of genetic and epigenetic features suitable for downstream analysis and biomarker identification using liquid biopsy.