We sequenced and annotated the genome of the filamentous fungus Fusarium graminearum , a major pathogen of cultivated cereals. Very few repetitive sequences were detected, and the process of repeat-induced point mutation, in which duplicated sequences are subject to extensive mutation, may partially account for the reduced repeat content and apparent low number of paralogous (ancestrally duplicated) genes. A second strain of F. graminearum contained more than 10,000 single-nucleotide polymorphisms, which were frequently located near telomeres and within other discrete chromosomal segments. Many highly polymorphic regions contained sets of genes implicated in plant-fungus interactions and were unusually divergent, with higher rates of recombination. These regions of genome innovation may result from selection due to interactions of F. graminearum with its plant hosts.

Plant pathogenic fungi of the genus Fusarium cause agriculturally important diseases of small grain cereals and maize. Trichothecenes are a class of mycotoxins produced by different Fusarium species that inhibit eukaryotic protein biosynthesis and presumably interfere with the expression of genes induced during the defense response of the plants. One of its members, deoxynivalenol, most likely acts as a virulence factor during fungal pathogenesis and frequently accumulates in grain to levels posing a threat to human and animal health. We report the isolation and characterization of a gene from Arabidopsis thaliana encoding a UDP-glycosyltransferase that is able to detoxify deoxynivalenol. The enzyme, previously assigned the identifier UGT73C5, catalyzes the transfer of glucose from UDP-glucose to the hydroxyl group at carbon 3 of deoxynivalenol. Using a wheat germ extract-coupled transcription/translation system we have shown that this enzymatic reaction inactivates the mycotoxin. This deoxynivalenol-glucosyltransferase (DOGT1) was also found to detoxify the acetylated derivative 15-acetyl-deoxynivalenol, whereas no protective activity was observed against the structurally similar nivalenol. Expression of the glucosyltransferase is developmentally regulated and induced by deoxynivalenol as well as salicylic acid, ethylene, and jasmonic acid. Constitutive overexpression in Arabidopsis leads to enhanced tolerance against deoxynivalenol. Plant pathogenic fungi of the genus Fusarium cause agriculturally important diseases of small grain cereals and maize. Trichothecenes are a class of mycotoxins produced by different Fusarium species that inhibit eukaryotic protein biosynthesis and presumably interfere with the expression of genes induced during the defense response of the plants. One of its members, deoxynivalenol, most likely acts as a virulence factor during fungal pathogenesis and frequently accumulates in grain to levels posing a threat to human and animal health. We report the isolation and characterization of a gene from Arabidopsis thaliana encoding a UDP-glycosyltransferase that is able to detoxify deoxynivalenol. The enzyme, previously assigned the identifier UGT73C5, catalyzes the transfer of glucose from UDP-glucose to the hydroxyl group at carbon 3 of deoxynivalenol. Using a wheat germ extract-coupled transcription/translation system we have shown that this enzymatic reaction inactivates the mycotoxin. This deoxynivalenol-glucosyltransferase (DOGT1) was also found to detoxify the acetylated derivative 15-acetyl-deoxynivalenol, whereas no protective activity was observed against the structurally similar nivalenol. Expression of the glucosyltransferase is developmentally regulated and induced by deoxynivalenol as well as salicylic acid, ethylene, and jasmonic acid. Constitutive overexpression in Arabidopsis leads to enhanced tolerance against deoxynivalenol. A complex of closely related species of the genus Fusarium is responsible for destructive and economically very important diseases of cereal crops (Fusarium head blight of wheat and barley) and maize (Fusarium ear rot). In years with climatic conditions that favor the development of the fungi, these infections can reach epidemic proportions (1McMullen M.P. Jones R. Gallenberg D. Plant Dis. 1997; 81: 1340-1348Crossref PubMed Scopus (1161) Google Scholar). Diseases caused by Fusarium do not only severely reduce yield but also result in contamination of grain with unacceptably high amounts of mycotoxins, a problem of world-wide significance. A toxin class of particular concern to human and animal health is the trichothecenes, sesquiterpenoid epoxides, which are potent inhibitors of eukaryotic protein synthesis. More than 180 compounds of this class have been isolated from natural sources, predominantly from Fusarium species (2Grove J.F. Progress in the Chemistry of Organic Natural Products. Springer, Wien, Austria1996: 1-70Google Scholar). Depending on the concentration and the substitution pattern of the trichothecene, either translational initiation, elongation, or termination are preferentially inhibited (3Cundliffe E. Davies J.E. Antimicrob. Agents Chemother. 1977; 11: 491-499Crossref PubMed Scopus (78) Google Scholar). Fusarium graminearum and Fusarium culmorum are the two most common causative agents of Fusarium head blight of cereals. F. graminearum lineages present in Europe and North America predominantly produce deoxynivalenol (DON) 1The abbreviations used are: DONdeoxynivalenol3-ADON3-acetyl-deoxynivalenol15-ADON15-acetyl-deoxynivalenolNIVnivalenolUGTUDP-glycosyltransferaseDOGT1DON-glucosyltransferase 1GUSβ-glucuronidaseSAsalicylic acidJAjasmonic acidACC1-aminocyclopropylcarbonic acidfwforwardrvreverseCol-0Columbia-0HPLChigh pressure liquid chromatographyLCliquid chromatographyMSmass spectrometryGSTglutathione S-transferase.1The abbreviations used are: DONdeoxynivalenol3-ADON3-acetyl-deoxynivalenol15-ADON15-acetyl-deoxynivalenolNIVnivalenolUGTUDP-glycosyltransferaseDOGT1DON-glucosyltransferase 1GUSβ-glucuronidaseSAsalicylic acidJAjasmonic acidACC1-aminocyclopropylcarbonic acidfwforwardrvreverseCol-0Columbia-0HPLChigh pressure liquid chromatographyLCliquid chromatographyMSmass spectrometryGSTglutathione S-transferase. as well as the acetylated derivatives 3-acetyl-deoxynivalenol (3-ADON) and 15-acetyl-deoxynivalenol (15-ADON), whereas producers of nivalenol (NIV), which contains one additional hydroxyl group (Fig. 1A), predominate in Asia (4O'Donnel K. Kistler H.C. Tacke B.K. Casper H.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 7905-7910Crossref PubMed Scopus (674) Google Scholar). While the toxicity of these trichothecenes is well studied in animal systems (5Betina V. Mycotoxins—Chemical, Biological and Environmental Aspects. Elsevier, Amsterdam1989: 192-241Google Scholar), fairly little is known about differences in phytotoxicity. In contrast to animal cells, NIV and T-2 toxin are less toxic than DON to wheat (6Eudes F. Comeau A. Rioux S. Collin J. Can. J. Plant Pathol. 2000; 22: 286-292Crossref Scopus (60) Google Scholar), which may indicate significant differences in uptake or metabolism of particular trichothecenes. Animal exposure to DON (also known as vomitoxin) has numerous adverse health effects with neural and immune system being the most sensitive targets (7Canady R.A. Coker R.D. Egan K. Krska R. Kuiper-Goodman T. Olsen M. Pestka J. Resnik S. Schlatter J. WHO Food Addit. Ser. 2001; 47: 419-528Google Scholar). In contrast to high doses of DON, which inhibit antibody production, low doses of DON act synergistically with bacterial lipopolysaccharide to stimulate proinflammatory processes (7Canady R.A. Coker R.D. Egan K. Krska R. Kuiper-Goodman T. Olsen M. Pestka J. Resnik S. Schlatter J. WHO Food Addit. Ser. 2001; 47: 419-528Google Scholar). To protect consumers, the United States Food and Drug Administration has established advisory levels for food. The European Community has also recently recommended action levels for DON (8Codex Committee on Food Additives and Contaminants Joint FAO/WHO Food Standards Programme. FAO-WHO Joint Office, Rome2003Google Scholar). 2www.mykotoxin.de/Dokumente/Codex%20DON%2012.02.pdf.2www.mykotoxin.de/Dokumente/Codex%20DON%2012.02.pdf. deoxynivalenol 3-acetyl-deoxynivalenol 15-acetyl-deoxynivalenol nivalenol UDP-glycosyltransferase DON-glucosyltransferase 1 β-glucuronidase salicylic acid jasmonic acid 1-aminocyclopropylcarbonic acid forward reverse Columbia-0 high pressure liquid chromatography liquid chromatography mass spectrometry glutathione S-transferase. deoxynivalenol 3-acetyl-deoxynivalenol 15-acetyl-deoxynivalenol nivalenol UDP-glycosyltransferase DON-glucosyltransferase 1 β-glucuronidase salicylic acid jasmonic acid 1-aminocyclopropylcarbonic acid forward reverse Columbia-0 high pressure liquid chromatography liquid chromatography mass spectrometry glutathione S-transferase. The role of DON in plant disease is still a matter of discussion (9McCormick S.P. Fusarium Head Blight of Wheat and Barley. American Phytopathological Society, St. Paul, MN2003: 165-183Google Scholar), but most of the evidence supports the hypothesis that it functions as a virulence factor. Fusarium mutants with a disrupted trichodiene synthase (Tri5) gene, involved in trichothecene biosynthesis, are still pathogenic. However, they exhibit reduced virulence on wheat (10Desjardins A.E. Procter R.H. Bai G. McCormick S.P. Shaner G. Buechley G. Hohn T. Mol. Plant-Microbe Interact. 1996; 9: 775-781Crossref Scopus (308) Google Scholar); they are unable to spread from the infection site (11Bai G.H. Desjardins A.E. Plattner R.D. Mycopathologia. 2002; 153: 91-98Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar). DON can move ahead of the fungus in infested plants, suggesting a role in conditioning host tissue for colonization (12Kang Z. Buchenauer H. Physiol. Mol. Plant Pathol. 1999; 55: 275-288Crossref Scopus (126) Google Scholar). Results of several studies indicate that the in vitro resistance of wheat cultivars toward DON correlates with Fusarium head blight resistance in the field (13Mesterhazy A. Fusarium Head Blight of Wheat. American Phytopathological Society, St. Paul, MN2003: 363-380Google Scholar). This is also the case for segregating experimental populations. 3M. Lemmens, personal communication.3M. Lemmens, personal communication. Increased resistance against toxic substances can result from several mechanisms, ranging from reduced uptake to bypass, overexpression, or mutation of the toxin target. Yet a very prominent process seems to be metabolic transformation often followed by compartmentation (14Coleman J.O.D. Blake-Kalff M.M.A. Davies T.G.E. Trends Plant Sci. 1997; 2: 144-151Abstract Full Text PDF Scopus (481) Google Scholar). An observed decline in the concentration of DON, which occurred in Fusarium-infected wheat in the field (15Scott P.M. Nelson K. Kanhere S.R. Karpinski K.F. Hayward S. Neish G.A. Teich A. Appl. Environ. Microbiol. 1984; 48: 884-886Crossref PubMed Google Scholar), suggests that the toxin may be metabolized. Two wheat cultivars differing in Fusarium resistance also differ in their ability to form a DON metabolite, suspected to be a glycoside (16Miller J.D. Arnison P.G. Can. J. Plant Pathol. 1986; 8: 147-150Crossref Scopus (162) Google Scholar). Sewald et al. (17Sewald N. von Gleissenthall J.L. Schuster M. Müller G. Aplin R.T. Tetrahedron Asymmetry. 1992; 3: 953-960Crossref Scopus (69) Google Scholar) used radiolabeled DON to show that it was primarily conjugated to 3-β-d-glucopyranosyl-4-deoxynivalenol in a maize suspension culture. No plant enzymes capable of modifying the trichothecene have been described so far. Genome sequencing projects have revealed the existence of a vast number of genes in plants that code for putative UDP-glycosyltransferases (UGTs), predicted to conjugate small molecules. For instance, Arabidopsis thaliana has been shown to harbor more than 100 members of this multigene family (18Ross J. Yi L. Lim E.K. Bowles D. Genome Biol. 2001; 2: 3004.1-3004.6Crossref Google Scholar) whose functions are largely unknown. Here we report the cloning of an Arabidopsis UGT by functional expression in yeast that is able to inactivate the Fusarium mycotoxin DON. Yeast Strains—The yeast strains used in this work are derived from YPH499 (Mat a, ade2–101oc, his3-Δ200, leu2-Δ1, lys2–801a, trp1-Δ1, ura3–52) (19Sikorski R.S. Hieter P. Genetics. 1989; 122: 19-27Crossref PubMed Google Scholar). Standard techniques (20Alani E. Cao L. Kleckner N. Genetics. 1987; 116: 541-545Crossref PubMed Scopus (744) Google Scholar, 21Güldener U. Heck S. Fielder T. Beinhauer J. Hegemann J.H. Nucleic Acids Res. 1996; 24: 2519-2524Crossref PubMed Scopus (1335) Google Scholar) were used to inactivate genes encoding ATP-binding cassette transporters. 4K. Kuchler, unpublished. The relevant genotype of strain YZGA452 is pdr5Δ::TRP1, pdr10Δ::hisG, snq2Δ::hisG, yor1Δ::hisG. YZGA515 (pdr5Δ::TRP1, pdr10Δ::hisG, pdr15Δ::loxP-KanMX-loxP, ayt1Δ::URA3) was constructed by disruption of the acetyltransferase AYT1 in strain YHW10515K. 4K. Kuchler, unpublished. In the ayt1Δ::URA3 construct nucleotides 343–1022 of the AYT1 reading frame are replaced by a 1.1-kb HindIII URA3 fragment. Plant Material and Growth Conditions—A. thaliana experiments were conducted with the wild-type ecotype Columbia-0 (Col-0). For propagation, seeds were sterilized, plated on standard Murashige and Skoog growth medium (22Murashige T. Skoog F. Plant Physiol. 1962; 15: 473-497Crossref Scopus (52758) Google Scholar) supplemented with 1.0% sucrose and 1.0% phytagar (Invitrogen), and subjected to a 2-day dark treatment at 4 °C to synchronize germination. The seedlings were grown for 2 weeks in a controlled environment of 16 h/8 h light-dark cycle (140 μmol m–2 s–1 white light) at 22 °C before they were transferred to soil and grown at 20 °C and 55% humidity under continuous white light. A. thaliana cDNA Library Screen in Yeast—The ATP-binding cassette transporter-deficient Saccharomyces cerevisiae strain YZGA452, which is hypersensitive to DON, was transformed with an A. thaliana cDNA library constitutively expressed under the control of the phosphoglycerate kinase (PGK1) promoter (23Minet M. Dufour M.-E. Lacroute F. Plant J. 1992; 2: 417-422PubMed Google Scholar). A total of 107 transformants were selected on minimal medium lacking uracil and transferred to medium containing 180 ppm DON (kindly provided by Marc Lemmens), a dose sufficient to completely inhibit growth of yeast transformed with the empty library plasmid. Colonies that showed resistance were isolated, and the plasmid dependence of the phenotype was tested by plasmid DNA preparation and retransformation of YZGA452. The NotI fragment containing the cDNA insert of the candidate was subcloned into pBluescript SKII+ (Stratagene) and sequenced. Constitutive Expression and Immunodetection of the DON-glucosyltransferase 1 (DOGT1) in Yeast—The intronless open reading frame of DOGT1 (UGT73C5, locus At2g36800) was PCR-amplified (Triple Master PCR system, Eppendorf) from genomic DNA using gene-specific primers containing flanking HindIII and NotI restriction sites at the 5′ and 3′ ends, respectively (fw, 5′-ACTAAGCTTGGAATCATGGTTTCCGAAACA-3′; rv, 5′-AAGCGGCCGCATACTCAATTATTGG-3′). The PCR products were cloned into the HindIII + NotI cloning sites of the yeast expression vector pYAK7 (PADH1-c-Myc-PDR5 LEU2 2μ), replacing the PDR5 gene. The vector pYAK7 was constructed by first inserting the double-stranded linker 5′-GGGATGCCCGAACAAAAGTTAATTTCAGAAGAGGACTTATCAAAGCTTGAGGCCTCGCGA-3′ into the SmaI site of vector pAD4Δ (24Ballester R. Michaeli T. Ferguson K. Xu H.-P. McCormick F Wigler M. Cell. 1989; 59: 681-686Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (95) Google Scholar), thus generating an N-terminal c-Myc epitope and a HindIII site into which a genomic HindIII fragment containing the yeast PDR5 was inserted in-frame. The tagged UGT construct was verified by sequencing and used to transform the yeast strain YZGA515. The empty vector (pYAK7 HindIII + NotI-digested and religated) was used as a control. Transformants were selected on synthetic complete medium lacking leucine. Exponentially growing cultures were diluted to A600 0.05 and spotted on YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) medium containing increasing concentrations of different trichothecenes. The toxins used were: DON, 3-ADON, 15-ADON, NIV, trichothecin, T-2 toxin, HT-2 toxin, diacetoxyscirpenol, and verrucarin A. With the exception of DON, 3-ADON, and NIV, which were obtained from Biopure Referenzsubstanzen GmbH (Tulln, Austria), mycotoxins were purchased from Sigma and stored at –20 °C dissolved in 70% ethanol. For immunodetection, the extraction of proteins from yeast cells was performed as described by Egner et al. (25Egner R. Mahe Y. Pandjaitan R. Kuchler K. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 5879-5887Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). Western blot analysis was conducted with a primary mouse anti-c-Myc antibody (1:5000, clone 9E10, Invitrogen). Synthesis of 3-β-d-Glucopyranosyl-4-deoxynivalenol and 15-β-d-Glu-copyranosyl-4-deoxynivalenol—To obtain reference material for HPLC and TLC, DON-3-glucoside and DON-15-glucoside were synthesized in two-step reactions. In the first step, 15-acetyl-DON or 3-acetyl-DON were modified with 1β-bromo-1-deoxy-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-d-glucopyranose (acetobromoglucose) in toluene with CdCO3 as catalyst to yield the DON-glucoside-acetates (26Savard M. J. Agric. Food Chem. 1991; 39: 570-574Crossref Scopus (44) Google Scholar). Gentle hydrolysis of the acetates to the glucosides was performed in the second step using a strong basic anion exchanger (Dowex 1 × 2–400, Aldrich). After checking the progress of the reaction with TLC (mobile phase: toluene/ethyl acetate, 1:1, v/v), the DON-glucosides were cleaned up using flash chromatography over silica gel with 1-butanol/1-propanol/ethanol/water (2:3:3:1, v/v/v/v). Further purification of the substances was performed with HPLC by means of an RP-18 Aquasil column (Keystone, Bellefonte, PA) using acetonitrile/water (10:90, v/v) at 22 °C. The synthesized DON derivatives were characterized in the negative electrospray interface mode. LC-MS/MS analysis was performed on a QTrap-LC-MS/MS system (Applied Biosystems, Foster City, CA) equipped with electrospray interface and a 1100 Series HPLC system (Agilent, Waldbronn, Germany). Chromatographic separation was achieved on a 150-mm × 4.6-mm-inner diameter, 3-μm, Aquasil RP-18 column (Keystone) at 22 °C using methanol/water (28:72, v/v). The flow rate was set to 0.3 ml/min. The electrospray interface was used in the negative ion mode at 400 °C with the following settings: curtain gas (CUR), 20 p.s.i.; nebulizer gas (GS1), 30 p.s.i.; auxiliary gas (GS2), 75 p.s.i.; ion spray voltage (IS), –4200 V; declustering potential (DP), –46 V; entrance potential, –9 V; collision energy (CE), –30 eV; collision-activated dissociation gas (CAD), high; linear ion trap fill time (LIT), 50 ms; quadrupole 3 entry barrier, 8 V. Isolation and Analysis of DON Metabolites in Vivo—To elucidate the chemical structure of DON metabolites resulting from enzymatic transformation of the mycotoxin by DOGT1, a highly tolerant strain was constructed, and the DON metabolite was extracted from toxin-treated cells for subsequent HPLC analysis. The yeast strain YZGA515 was transformed with c-Myc-tagged DOGT1 under the control of the constitutive ADH1 promoter and with plasmid pRM561. This plasmid contains a mutant version of the ribosomal protein L3 (RPL3) of S. cerevisiae that substantially increases DON resistance when expressed in yeast. 5R. Mitterbauer, B. Poppenberger, A. Raditschnig, D. Lucyshyn, M. Lemmens, J. Glössl, and G. Adam, manuscript in preparation. Transformants were selected on synthetic complete medium lacking leucine and adenine. The resultant yeast strain was grown to an A600 0.7 in selective medium (synthetic complete lacking leucine and adenine). Cells were transferred to adenine-supplemented YPD medium (10% glucose), grown for 2 h at 30 °C, harvested by centrifugation, and diluted to an A600 of 3.0 in YPD. DON was added to 5 ml of culture starting at a dose of 200 ppm. After 3 h the concentration was increased to 400 ppm, after 6 h the concentration was increased to 600 ppm, and after 9 h the concentration was increased to 1,000 ppm. The cells were incubated for an additional 15 h at 30 °C. The cells were then harvested, washed three times with ice-cold water, extracted in 2.5 ml of methanol/water (4:1), and sonicated. After centrifugation the supernatant was filtered through a glass microfiber filter (Whatman 1822 025). 500-μl aliquots of the yeast extracts were concentrated to dryness under a constant stream of nitrogen and dissolved in 100 μl of HPLC-grade water. Heterologous Expression of DOGT1 in Escherichia coli—The DOGT1 protein was expressed in E. coli XL1-blue as a GST fusion. The DOGT1 gene was isolated from the yeast expression vector by HindIII digestion and Klenow fill-in followed by a NotI digest. The resulting fragment was cloned into the SmaI + NotI sites of the GST gene fusion vector pGEX-4T-3 (Amersham Biosciences). The recombinant fusion protein was purified using glutathione-coupled Sepharose (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's instructions. To test the effect of the N-terminal GST tag on activity, the gene encoding the fusion protein was PCR-amplified using DNA polymerase with proof reading activity (Pfu polymerase, MBI) and the fusion protein-specific primers GSTDOGpYAK7-fw (5′-TCACCCGGGAAACAGTAATCATGTCC-3′) and GSTDOGpYAK7-rv (5′-CGAGGCAGATCGTCAGTCAGTC-3′). The PCR product was cloned into the HindIII + NotI sites of the yeast expression vector pYAK7. DON detoxification ability was tested by expression in YZGA515 and application to toxin-containing medium as described above. Enzyme Assays—The glucosyltransferase activity assay mixture contained 1 μg of recombinant GST fusion protein, 10 mm 2-mercaptoethanol, 50 mm Tris-HCl, pH 7.0, 0.5 mm radioactive labeled UDP-[14C]glucose (4.4 × 103 cpm, PerkinElmer Life Sciences), 0.01% bovine serum albumin, and a 1 mm concentration of acceptor substrate (dissolved in Me2SO in 20 mm stock solutions). The reactions were carried out in 20-μl volumes at 30 °C for 1 h, stopped by adding 2 μl of trichloroacetic acid (240 mg/ml), frozen, and then stored at –20 °C. Analysis of reaction products was performed by TLC. An aliquot of each sample was spotted on a silica gel plate (Kieselgel 60, Merck) and developed with a mixture of 1-butanol/1-propanol/ethanol/water (2:3: 3:1, v/v/v/v). The intensity of each radioactive spot was determined using a PhosphorImager (STORM 860 system, Amersham Biosciences). The plates were additionally stained with p-anisaldehyde (0.5% in methanol/H2SO4/acetic acid, 85:5:10, v/v/v). Inhibition of Wheat Ribosomes in Vitro—To analyze whether the 3-β-d-glucopyranosyl-4-deoxynivalenol is less phytotoxic than its aglycone, we used a wheat germ extract-coupled in vitro transcription/translation system (TnT coupled wheat germ extract, T3, Promega). After performing transcription/translation reactions for 25 min according to the manufacturer's instructions (in the presence of either DON, purified DON-glucoside (1, 2.5, 5, 10, and 20 μm), or water as a control), the activity of the firefly luciferase reporter was determined (luciferase assay system, Promega) using a luminometer (Victor 2, Wallac). Plant Treatment with Different Stress Response-related Compounds for Expression Analysis—For reverse transcription-PCR analysis of mRNA expression of DOGT1 following treatments with DON, salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), and 1-aminocyclopropylcarbonic acid (ACC) seedlings were grown for 2 weeks on vertical Murashige and Skoog plates (0.8% phytagar) before they were transferred to liquid Murashige and Skoog medium. The plants were incubated for 48 h on an orbital shaker (50 rpm) before adding 5 ppm DON, 200 μm SA, 2 μm ACC, or 50 μm JA. The compounds were kept as stock solutions dissolved either in 70% ethanol or in Me2SO. Ethanol and Me2SO treatments were performed as controls. Plants were harvested at different time points, ground in liquid nitrogen, and stored at –70 °C until RNA extraction was performed. Analysis of mRNA Expression of DOGT1 by Reverse Transcriptase PCR—Total RNA was isolated from plant tissue ground in liquid nitrogen with TriZol reagent as recommended by the manufacturer (Invitrogen). RNA was quantified photometrically and visually on a denaturing RNA gel analyzing 5 μg of total RNA. cDNA was synthesized from 1 μg of total RNA (digested with DNase I) using 500 ng of an 18-mer oligo(dT) and SuperScript reverse transcriptase (Invitrogen). PCR was performed with ∼2 μl of the 1:20 diluted cDNA using primers that amplify C-terminal fragments of DOGT1 and the UBQ5 control gene: DOGRT-fw, 5′-ATCCGGGGTTGAACAGCCT-3′; DOGRT-rv, 5′-TCAATTATTGGGTTCTGCC-3′; UBQ5-U, 5′-GTCCTTCTTTCTGGTAAACGT-3′; UBQ5-D, 5′-AACC CTTGAGGTTGAATCATC-3′). To compare relative amounts of transcripts in the samples, DNA fragments of the UBQ5 were first amplified, and normalized sample volumes, based on the amount of products corresponding to the UBQ5 transcripts, were used for PCR. Cloning of Plant Overexpression and GUS Fusion Constructs—For constitutive overexpression of c-Myc-tagged DOGT1 protein in Arabidopsis, the vector pBP1319 was constructed. It is derived from a modified version of the plant expression vector pPZP221 (27Hajdukiewicz P. Svab Z. Maliga P. Plant Mol. Biol. 1994; 25: 989-994Crossref PubMed Scopus (1304) Google Scholar). The promoter cassette, consisting of two copies of the 35S promoter and the polyadenylation signal of cauliflower mosaic virus strain Cabb B-D, came from the vector p2RT, a modified version of pRT100 (28Töpfer R. Matzeit V. Groneborn B. Schell J. Steinbiss H.-H. Nucleic Acids Res. 1987; 14: 5890Crossref Scopus (404) Google Scholar). The c-Myc-tagged DOGT1 fragment was released by SmaI + NotI digestion (Klenow-filled) from the yeast expression vector and cloned into ClaI + SmaI-digested pBluescript SKII+, which was treated with Klenow enzyme. In the next step, the gene was excised from the resulting plasmid as a SalI +BamHI fragment and inserted in the XhoI + BamHI sites of p2RT. The obtained 2x35S c-Myc-DOGT1 cassette was isolated by PstI digestion and cloned into the unique PstI site of pPZP221 after the multiple cloning site in that vector had been destroyed by digesting the plasmid with EcoRI + SalI, filling the sites with Klenow, and religating it (p235a). 6N. Malenica, unpublished. In the resulting vector pBP1319, the 2x35S c-Myc-DOGT1 cassette is orientated in the opposite direction than the 2x35S gentamycin resistance marker. For construction of a transcriptional DOGT1-GUS fusion, the GUS vector pPZP-GUS.1, which originates from pPZP200 and contains the GUS gene from pBI101.1 (inserted by HindIII + EcoRI digestion into the MCS), was used (29Diener A.C. Li H. Zhou W. Whoriskey W.J. Nes W.D. Fink G.R. Plant Cell. 2000; 12: 853-870Crossref PubMed Scopus (209) Google Scholar). The DOGT1 promoter region was PCR-amplified from genomic DNA using a DNA polymerase with proof reading activity (Pfu polymerase, MBI) and specific primers (DOGP-GUS-fw, 5′-GTTAAAAGCTTACATGTGCATTACGGTCTGTGTGAATA; DOGP-GUS-rv, 5′-TTTCGGATCCCATG ATTCAACCTTAGTAAGAAACTCTC). The resulting product was cloned in-frame with the GUS gene by HindIII + BamHI digestion into the pPZP-GUS.1 vector. Constructs were confirmed by DNA sequencing. Generation and Analysis of Transgenic A. thaliana—For all plant transformations, the recA-deficient Agrobacterium tumefaciens strain UIA143 (30Farrand S.K. O'Morchoe S.P. McCutchan J. J. Bacteriol. 1989; 171: 5314-5321Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar), which harbors the helper plasmid pMP90 (31Koncz C. Schell J. Mol. Gen. Genet. 1986; 204: 383-396Crossref Scopus (1545) Google Scholar), was used. A. thaliana was transformed applying the floral dip technique (32Clough S.J. Bent A.F. Plant J. 1998; 16: 735-743Crossref PubMed Google Scholar). The progeny of 15 independent transformants were selected through three generations to obtain homozygous lines. For immunodetection of c-Myc-tagged DOGT1, about 200–500 mg of plant material were homogenized in liquid nitrogen. 300 μl of extraction buffer (200 mm Tris-HCl, pH 8.9, 200 mm KCl, 35 mm MgCl2, 12.5 mm EGTA, 15 mm dithiothreitol, 0.6 mm sorbitol) and 15 μl of protease inhibitor mixture (Sigma catalog no. 9599) were added to the still frozen samples, and the mixture was incubated with vigorous shaking for 15 min at 4 °C. After centrifugation (14,000 rpm for 15 min at 4 °C), 200-μl aliquots of the supernatants were transferred into fresh tubes and stored at –20 °C. Equivalent amounts of protein (50 μg) were used for Western blot analysis, which was carried out using primary anti-c-Myc antibody purified from hybridoma supernatant (clone 9E10). For analysis of DON resistance, seeds of homozygous lines exhibiting high DOGT1 expression and Col-0 as control were germinated on Murashige and Skoog media containing different concentrations of DON (5–30 ppm). Seedlings were grown for 5 weeks before the phenotype was documented. GUS activity was analyzed by staining seedlings or organs of adult plants in 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid (X-Gluc) solution for 2–4 h at 37 °C (33Jefferson R.A. Plant Mol. Biol. Rep. 1987; 5: 387-405Crossref Scopus (3992) Google Scholar). Isolation of the DOGT1 by Heterologous Expression in Yeast—To identify plant genes that contribute to mycotoxin resistance, an unbiased functional screen based on heterologous expression of cDNAs in yeast was set up. Wild-type S. cerevisiae is highly resistant to DON. To reduce the amount of toxin necessary for the screen, we generated a strain deficient in four ATP-binding cassette transporters, which are to a large extent responsible for pleiotropic drug resistance in yeast (34Wolfger H. Mamnun Y.M. Kuchler K. Res. Microbiol. 2001; 152: 375-389Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). Strain YZGA452 (snq2Δ::hisG pdr5Δ::TRP1 pdr10Δ::hisG yor1Δ::hisG) is hypersensitive to a wide range of different xenobiotic substances and natural products, including DON (data not shown). YZGA452 was transformed with a cDNA expression library of A. thaliana (23Minet M. Dufour M.-E. Lacroute F. Plant J. 1992; 2: 417-422PubMed Google Scholar) in which cDNAs are constitutively expressed under the control of the yeast phosphoglycerate kinase promoter. Ten million transformants were generated, and diluted pools of transformants were plated on DON-containing medium. After selection of DON-resistant yeast colonies and confirmation of the plasmid dependence of the phenotype, the insert was subcloned a

Using specular reflection of neutrons, we investigate for the first time the structure of a single dimyristoylphosphatidylcholine bilayer adsorbed to a planar quartz surface in an aqueous environment. We demonstrate that the bilayer is strongly adsorbed to the quartz surface and is stable to phase state changes as well as exchange of the bulk aqueous phase. Our results show that the main phase transition is between the L alpha phase and the metastable L beta'* phase, with formation of the P beta' ripple phase prevented by lateral stress on the adsorbed bilayer. By performing contrast variation experiments, we are able to elucidate substantial detail in the interfacial structure. We measure a bilayer thickness of 43.0 +/- 1.5 A in the L alpha phase (T = 31 degrees C) and 46.0 +/- 1.5 A in the L beta'* phase (T = 20 degrees C). The polar head group is 8.0 +/- 1.5 A thick in the L alpha phase. The water layer between the quartz and bilayer is 30 +/- 10 A for the lipid in both the L alpha and L'* phase. Our results agree well with those previously reported from experiments using lipid vesicles and monolayers, thus establishing the feasibility of our experimental methods.

Research Article1 May 1993free access A Saccharomyces cerevisiae UAS element controlled by protein kinase A activates transcription in response to a variety of stress conditions. G. Marchler G. Marchler Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. Search for more papers by this author C. Schüller C. Schüller Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. Search for more papers by this author G. Adam G. Adam Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. Search for more papers by this author H. Ruis H. Ruis Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. Search for more papers by this author G. Marchler G. Marchler Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. Search for more papers by this author C. Schüller C. Schüller Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. Search for more papers by this author G. Adam G. Adam Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. Search for more papers by this author H. Ruis H. Ruis Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. Search for more papers by this author Author Information G. Marchler1, C. Schüller1, G. Adam1 and H. Ruis1 1Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie, Universität Wien, Austria. The EMBO Journal (1993)12:1997-2003https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1993.tb05849.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Transcription of the Saccharomyces cerevisiae CTT1 gene encoding the cytosolic catalase T is activated by a variety of stress conditions: it is derepressed by nitrogen starvation and induced by heat shock. Furthermore, it is activated by osmotic and oxidative stress. This study shows that a CTT1 upstream region previously found to be involved in nitrogen, cAMP and heat control (base pairs −382 to −325) contains a UAS element (STRE, −368 to −356), which is sufficient for the activation of a reporter gene by all types of stress acting on CTT1. Gel retardation experiments demonstrated the existence of a factor specifically binding to STRE, but to a lesser extent to mutated elements having partly or entirely lost the ability to mediate stress control. Heat activation of STRE, but not of a canonical heat shock element, is enhanced by a ras2 defect mutation, which enhances thermotolerance, and is dramatically reduced by a bcy1 disruption mutation, which decreases thermotolerance. It can be hypothesized, therefore, that the novel stress control element is important for the establishment of induced stress tolerance. Previous ArticleNext Article Volume 12Issue 51 May 1993In this issue RelatedDetailsLoading ...

We investigated the hypothesis that resistance to deoxynivalenol (DON) is a major resistance factor in the Fusarium head blight (FHB) resistance complex of wheat. Ninety-six double haploid lines from a cross between ‘CM-82036’ and ‘Remus’ were examined. The lines were tested for DON resistance after application of the toxin in the ear, and for resistances to initial infection and spread of FHB after artificial inoculation with Fusarium spp. Toxin application to flowering ears induced typical FHB symptoms. Quantitative trait locus (QTL) analyses detected one locus with a major effect on DON resistance (logarithm of odds = 53.1, R 2 = 92.6). The DON resistance phenotype was closely associated with an important FHB resistance QTL, Qfhs.ndsu-3BS, which previously was identified as governing resistance to spread of symptoms in the ear. Resistance to the toxin was correlated with resistance to spread of FHB (r = 0.74, P < 0.001). In resistant wheat lines, the applied toxin was converted to DON-3-O-glucoside as the detoxification product. There was a close relation between the DON-3-glucoside/DON ratio and DON resistance in the toxintreated ears (R 2 = 0.84). We conclude that resistance to DON is important in the FHB resistance complex and hypothesize that Qfhs.ndsu-3BS either encodes a DON-glucosyltransferase or regulates the expression of such an enzyme.

Conjugated mycotoxins, in which the toxin is usually bound to a more polar substance like glucose, are referred to as masked mycotoxins, as these substances escape routine detection methods but can release their toxic precursors after hydrolysis. This is the first report on the natural occurrence of a glucoside of deoxynivalenol (DON) in Fusarium-infected wheat and maize. To obtain appropriate standards, we chemically synthesized deoxynivalenol-3-beta-D-glucopyranoside (DON-3-glucoside) and deoxynivalenol-15-beta-D-glucopyranoside (DON-15-glucoside). The synthesis products were characterized by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The DON-glucosides showed different collision-induced dissociation (CID) fragmentation behaviors and could therefore be distinguished. Wheat plants were either treated with DON (n = 52) or with Fusarium spp. (n = 4) at anthesis, and after harvest, wheat ears were analyzed for DON and DON-glucosides. All 56 treated wheat samples contained DON and a DON-glucoside with the same retention time, molecular mass, and CID fragmentation behavior as the synthetic DON-3-glucoside. Moreover, the DON-glucoside was also found in two out of three analyzed naturally DON-contaminated maize and in five out of five naturally contaminated wheat samples, in a range from 4 to 12% of the DON concentration. To further confirm the identity of the DON-glucoside, the compound was isolated from wheat extracts and characterized as DON-3-glucoside with NMR. The results of this study indicate the importance to consider both DON and DON-3-glucoside with regard to food and feed safety.

Deoxynivalenol-3-β-D-glucoside (D3G), a plant phase II metabolite of the Fusarium mycotoxin deoxynivalenol (DON), occurs in naturally contaminated wheat, maize, oat, barley and products thereof. Although considered as a detoxification product in plants, the toxicity of this substance in mammals is currently unknown. A major concern is the possible hydrolysis of the D3G conjugate back to its toxic precursor mycotoxin DON during mammalian digestion. We used in vitro model systems to investigate the stability of D3G to acidic conditions, hydrolytic enzymes and intestinal bacteria, mimicking different stages of digestion. D3G was found resistant to 0.2 M hydrochloric acid for at least 24 h at 37 °C, suggesting that it will not be hydrolyzed in the stomach of mammals. While human cytosolic β-glucosidase also had no effect, fungal cellulase and cellobiase preparations could cleave a significant portion of D3G. Most importantly, several lactic acid bacteria such as Enterococcus durans, Enterococcus mundtii or Lactobacillus plantarum showed a high capability to hydrolyze D3G. Taken together these data indicate that D3G is of toxicological relevance and should be regarded as a masked mycotoxin.

Zusammenfassung Die Verbindungen zwischen Mykotoxinen, Serotonin und psychischen Erkrankungen, insbesondere Psychosen, und wie Umwelt- und Stoffwechselfaktoren zur Stressbewältigung beitragen, sollen in unserem Beitrag aufgezeigt werden. Zunächst wird auf die Organismus-Pilz-Interaktion eingegangen: Pilze interagieren mit anderen eukaryoten Organismen auf einem Spektrum von Parasitismus, Kommensalismus bis hin zum Mutualismus, was man als Symbiose bezeichnen könnte. Ihre Metaboliten können toxisch sein und das Serotoninsystem beeinflussen, welches eine wichtige Rolle in der menschlichen Homöostase, Immunabwehr und psychischen Gesundheit spielt. Eine möglicherweise zentrale Rolle kommt hier dem Tryptophanstoffwechsel zu: Tryptophan (Trp) ist eine essenzielle Aminosäure, die zu Serotonin und Melatonin umgewandelt wird, den Botenstoffen zentraler Transmittersysteme des Menschen. Stress und Mykotoxine beeinflussen diesen Stoffwechselweg und können den Serotoninspiegel verändern, was wiederum das Risiko für Stimmungs- und Angststörungen erhöht. Chronischer Stress kann über Beeinträchtigung des Trp-Haushaltes zum Anfallen von neurotoxischen Abbauprodukten führen sowie die Verfügbarkeit von Serotonin reduzieren, was zu kognitiven Einschränkungen führen kann. Enge Verbindungen von Mykotoxinen und Stresszuständen können auf verschiedenen Ebenen, von molekularer Interaktion bis zum Einfluss auf das soziale Verhalten des Wirtes, dargestellt werden: Mykotoxine wie Aflatoxine und Ochratoxine fördern oxidativen Stress und Entzündungen, was die kognitive Leistung beeinträchtigen und das Risiko für neurodegenerative Erkrankungen durch Blut-Hirn-Schrankenstörungen erhöhen könnte. Am Beispiel der Ergotalkaloide werden, ausgehend vom historischen Ergotismus, Parallelen aufgezeigt: Ergotalkaloide, produziert durch den Mutterkornpilz, sind für ihre neurotoxische Wirkung bekannt und können Psychosen und Durchblutungsstörungen verursachen. Durch die heutigen Lebensmittelkontrollen werden die Belastungen mit Mykotoxinen möglichst gering gehalten. Dennoch kann es durch Interaktion von Lebensmittelzusätzen, wie Aspartam, zu toxischen Interaktionen mit Mykotoxinen kommen, wenn sie gemeinsam aufgenommen werden. Die Prävention wird in der vorliegenden Literatur als wichtiger Faktor betont: Eine stressreduzierende Lebensweise, eine gesunde Ernährung und eine saubere Wohnumgebung seien essenziell, um die potenziell negativen Effekte von Mykotoxinen zu minimieren und psychische Stabilität zu fördern.

ABSTRACT Butenolide (BUT, 4-acetamido-4-hydroxy-2-butenoic acid gamma-lactone) is a secondary metabolite produced by several Fusarium species and is co-produced with the major trichothecene mycotoxin deoxynivalenol (DON) on cereal grains throughout the world. BUT has low acute toxicity and only very limited occurrence and exposure data are available. The intestinal epithelium represents the first physiological barrier against food contaminants. We aimed to elucidate the intestinal inflammatory response of the human, non-cancer epithelial HCEC-1CT cells to BUT and to characterize potential combinatory interactions with co-occurring trichothecenes, such as DON and NX-3. Using a reporter gene approach, BUT (≥5 μ M, 20 h) was found to decrease lipopolysaccharide (LPS; 10 ng/mL) induced nuclear factor kappa B (NF-κB) activation in a dose-dependent manner, and in combinatory treatments represses trichothecene-induced enhancement of this important inflammatory pathway. Analyzing transcription and secretion levels of NF-κB-dependent, pro-inflammatory cytokines, revealed a significant down-regulation of IL-1β, IL-6 and TNF-α in IL-1β-stimulated (25 ng/mL) HCEC-1CT cells after BUT exposure (10 μ M). Trichothecene-induced expression of pro-in-flammatory cytokines by the presence of 1 μ M DON or NX-3 was substantially suppressed in the presence of 10 μ M BUT. The emerging mycotoxin BUT has the ability to suppress NF-κB-induced intestinal inflammatory response mechanisms and to modulate substantially the immune responsiveness of HCEC-1CT cells after trichothecene treatment. Our results suggest that BUT, present in naturally occurring mixtures of Fusarium fungal metabolites, should be increasingly monitored, and the mechanism of inhibition of NF-κB that might affect the pathogenesis or progression of intestinal inflammatory disorders, should be further investigated.