Abstract Targeted therapy against the BRAF/mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is a promising new therapeutic approach for the treatment of melanoma. Treatment with selective BRAF inhibitors results in a high initial response rate but limited duration of response. To counter this, investigators propose combining this therapy with other targeted agents, addressing the issue of redundancy and signaling through different oncogenic pathways. An alternative approach is combining BRAF/MAPK-targeted agents with immunotherapy. Preliminary evidence suggests that oncogenic BRAF (BRAFV600E) contributes to immune escape and that blocking its activity via MAPK pathway inhibition leads to increased expression of melanocyte differentiation antigens (MDA). Recognition of MDAs is a critical component of the immunologic response to melanoma, and several forms of immunotherapy capitalize on this recognition. Among the various approaches to inhibiting BRAF/MAPK, broad MAPK pathway inhibition may have deleterious effects on T lymphocyte function. Here, we corroborate the role of oncogenic BRAF in immune evasion by melanoma cells through suppression of MDAs. We show that inhibition of the MAPK pathway with MAPK/extracellular signal-regulated kinase kinase (MEK) inhibitors or a specific inhibitor of BRAFV600E in melanoma cell lines and tumor digests results in increased levels of MDAs, which is associated with improved recognition by antigen-specific T lymphocytes. However, treatment with MEK inhibitors impairs T lymphocyte function, whereas T-cell function is preserved after treatment with a specific inhibitor of BRAFV600E. These findings suggest that immune evasion of melanomas mediated by oncogenic BRAF may be reversed by targeted BRAF inhibition without compromising T-cell function. These findings have important implications for combined kinase-targeted therapy plus immunotherapy for melanoma. Cancer Res; 70(13); 5213–9. ©2010 AACR.

The incidence of primary cutaneous melanoma has been increasing dramatically for several decades. Melanoma accounts for the majority of skin cancer–related deaths, but treatment is nearly always curative with early detection of disease. In this update of the guidelines of care, we will discuss the treatment of patients with primary cutaneous melanoma. We will discuss biopsy techniques of a lesion clinically suspicious for melanoma and offer recommendations for the histopathologic interpretation of cutaneous melanoma. We will offer recommendations for the use of laboratory and imaging tests in the initial workup of patients with newly diagnosed melanoma and for follow-up of asymptomatic patients. With regard to treatment of primary cutaneous melanoma, we will provide recommendations for surgical margins and briefly discuss nonsurgical treatments. Finally, we will discuss the value and limitations of sentinel lymph node biopsy and offer recommendations for its use in patients with primary cutaneous melanoma. The incidence of primary cutaneous melanoma has been increasing dramatically for several decades. Melanoma accounts for the majority of skin cancer–related deaths, but treatment is nearly always curative with early detection of disease. In this update of the guidelines of care, we will discuss the treatment of patients with primary cutaneous melanoma. We will discuss biopsy techniques of a lesion clinically suspicious for melanoma and offer recommendations for the histopathologic interpretation of cutaneous melanoma. We will offer recommendations for the use of laboratory and imaging tests in the initial workup of patients with newly diagnosed melanoma and for follow-up of asymptomatic patients. With regard to treatment of primary cutaneous melanoma, we will provide recommendations for surgical margins and briefly discuss nonsurgical treatments. Finally, we will discuss the value and limitations of sentinel lymph node biopsy and offer recommendations for its use in patients with primary cutaneous melanoma. DisclaimerAdherence to these guidelines will not ensure successful treatment in every situation. Furthermore, these guidelines should not be interpreted as setting a standard of care, or be deemed inclusive of all proper methods of care nor exclusive of other methods of care reasonably directed to obtaining the same results. The ultimate judgment regarding the propriety of any specific therapy must be made by the physician and the patient in light of all the circumstances presented by the individual patient, and the known variability and biological behavior of the disease. This guideline reflects the best available data at the time the guideline was prepared. The results of future studies may require revisions to the recommendations in this guideline to reflect new data.ScopeThis guideline addresses the treatment of patients with primary cutaneous melanoma (including those in the nail unit), who may also have clinical or histologic evidence of regional disease, from the perspective of the US dermatologist. The guideline does not address primary melanoma of the mucous membranes. A discussion of adjuvant therapies for patients with high-risk melanoma (stage ≥IIB), such as interferon and radiation therapy, falls outside the scope of this guideline. Consultation with a physician or multidisciplinary group with specific expertise in melanoma, such as a medical oncologist, surgical oncologist, radiation oncologist, or dermatologist specializing in melanoma, should be considered for patients with high-risk melanoma. Finally, as an extensive discussion beyond the management of melanoma falls outside the scope of the current guidelines, the expert work group recommends that separate guidelines be developed on screening and surveillance for early detection, clinical diagnosis of primary cutaneous melanoma, and the molecular assessment of borderline/indeterminate melanocytic lesions.MethodA work group of recognized melanoma experts was convened to determine the audience and scope of the guideline, and identify important clinical questions in the management of primary cutaneous melanoma (Table I). Work group members completed a disclosure of commercial support that was updated throughout guideline development.Table IClinical questions used to structure evidence review for management of primary cutaneous melanomaWhat is the standard grading system for melanoma?What clinical and histologic information is useful in the pathology report?What are standard biopsy techniques?What are recommended surgical margins stratified by grading system?What is the effectiveness of sentinel node biopsy?∗New clinical questions for 2010 guideline.What diagnostic laboratory and imaging tests are useful in asymptomatic patients with primary cutaneous melanoma?What is the effectiveness of imiquimod?∗New clinical questions for 2010 guideline.What is the effectiveness of cryotherapy?∗New clinical questions for 2010 guideline.What is the effectiveness of radiation?∗New clinical questions for 2010 guideline.What is effective for follow-up of asymptomatic patients with primary cutaneous melanoma to detect metastases and/or additional primary melanomas?How long should asymptomatic patients be followed up?What diagnostic and imaging tests are effective in follow-up of asymptomatic patients?∗ New clinical questions for 2010 guideline. Open table in a new tab An evidence-based model was used and evidence was obtained using a search of the PubMed database spanning the years 2000 through 2010 for clinical questions addressed in the previous version of this guideline published in 2001, and 1960 to 2010 for all newly identified clinical questions. Only English-language publications were reviewed. Published guidelines on melanoma were also evaluated.1Coit D.G. Andtbacka R. Bichakjian C.K. Dilawari R.A. Dimaio D. Guild V. et al.Melanoma.J Natl Compr Canc Netw. 2009; 7: 250-275PubMed Google Scholar, 2Marsden J.R. Newton-Bishop J.A. Burrows L. Cook M. Corrie P.G. Cox N.H. et al.Revised UK guidelines for the management of cutaneous melanoma 2010.Br J Dermatol. 2010; 163: 238-256Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar, 3Australian Cancer Network, New Zealand Guidelines Group, Cancer Council Australia, New ZealandMinistry of Health. Clinical practice guidelines for the management of melanoma in Australia and New Zealand: evidence-based best practice guidelines. Australian Cancer Network, Sydney, N.S.W.2008Google ScholarThe available evidence was evaluated using a unified system called the Strength of Recommendation Taxonomy developed by editors of the US family medicine and primary care journals (ie, American Family Physician, Family Medicine, Journal of Family Practice, and BMJ USA). This strategy was supported by a decision of the Clinical Guidelines Task Force in 2005 with some minor modifications for a consistent approach to rating the strength of the evidence of scientific studies.4Ebell M.H. Siwek J. Weiss B.D. Woolf S.H. Susman J.L. Ewigman B. et al.Simplifying the language of evidence to improve patient care: strength of recommendation taxonomy (SORT); a patient-centered approach to grading evidence in medical literature.J Fam Pract. 2004; 53: 111-120PubMed Google Scholar Evidence was graded using a 3-point scale based on the quality of methodology as follows:I.Good-quality patient-oriented evidence (ie, evidence measuring outcomes that matter to patients: morbidity, mortality, symptom improvement, cost reduction, and quality of life).II.Limited-quality patient-oriented evidence.III.Other evidence including consensus guidelines, opinion, case studies, or disease-oriented evidence (ie, evidence measuring intermediate, physiologic, or surrogate end points that may or may not reflect improvements in patient outcomes).Clinical recommendations were developed on the best available evidence tabled in the guideline. These are ranked as follows:A.Recommendation based on consistent and good-quality patient-oriented evidence.B.Recommendation based on inconsistent or limited-quality patient-oriented evidence.C.Recommendation based on consensus, opinion, case studies, or disease-oriented evidence.In those situations where documented evidence-based data are not available, we have used expert opinion to generate our clinical recommendations. This guideline has been developed in accordance with the American Academy of Dermatology (AAD)/AAD Association “Administrative Regulations for Evidence-based Clinical Practice Guidelines” (version approved March 2009), which include the opportunity for review and comment by the entire AAD membership and final review and approval by the AAD Board of Directors.DefinitionPrimary cutaneous melanoma is defined as any primary melanoma lesion, regardless of tumor thickness, in patients without clinical or histologic evidence of regional or distant metastatic disease (stage 0-IIC).IntroductionSince the last publication of the guidelines of care for primary cutaneous melanoma by the American Academy of Dermatology in 2001, the most significant changes in the management of primary melanoma are a result of the acknowledgment of the dermal mitotic rate as an important prognostic parameter.5Sober A.J. Chuang T.Y. Duvic M. Farmer E.R. Grichnik J.M. Halpern A.C. et al.Guidelines of care for primary cutaneous melanoma.J Am Acad Dermatol. 2001; 45: 579-586Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (124) Google Scholar, 6Balch C.M. Gershenwald J.E. Soong S.J. Thompson J.F. Atkins M.B. Byrd D.R. et al.Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification.J Clin Oncol. 2009; 27: 6199-6206Crossref PubMed Scopus (764) Google Scholar This change is reflected in the recently published seventh edition of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) staging system for melanoma, effective January 1, 2010 (Table II, Table III).7Balch C.M. Gershenwald J.E. Atkins M.B. Buzaid A.C. Cascinelli N. Cochran A.J. et al.Chapter 31. Melanoma of the skin.in: Edge S.B. Byrd D.R. Compton C.C. Fritz A.G. Greene F.L. Trotti A. AJCC cancer staging manual. Springer, New York2009: 325-344Google Scholar In the new staging system, mitotic rate has replaced Clark level of invasion as the second factor predicting melanoma survival in addition to tumor (Breslow) thickness for tumors less than or equal to 1 mm in thickness.Table II2010 American Joint Committee on Cancer TNM definitionsUsed with permission of American Joint Committee on Cancer (AJCC), Chicago, IL. Original source for this material is AJCC Cancer Staging Manual, Seventh Edition (2010) published by Springer Science and Business Media LLC, www.springer.com.Primary tumor (T)TXPrimary tumor cannot be assessed (eg, curettaged or severely regressed melanoma)T0No evidence of primary tumorTisMelanoma in situT1Melanomas ≤1.0 mm in thicknessT2Melanomas 1.01-2.0 mmT3Melanomas 2.01-4.0 mmT4Melanomas >4.0 mmNote: a and b subcategories of T are assigned based on ulceration and No. of mitoses per mm2 as shown below:T classificationThickness, mmUlceration status/mitosesT1≤1.0a: Without ulceration and <1 mitosis/mm2b: With ulceration or ≥1 mitosis/mm2T21.01-2.0a: Without ulcerationb: With ulcerationT32.01-4.0a: Without ulcerationb: With ulcerationT4>4.0a: Without ulceration b: With ulcerationRegional lymph nodes (N)NXPatients in whom regional lymph nodes cannot be assessed (eg, previously removed for another reason)N0No regional metastases detectedN1-3Regional metastases based on No. of metastatic nodes and presence or absence of intralymphatic metastases (in transit or satellite)Note: N1-3 and a-c subcategories assigned as shown below:N classificationNo. of metastatic nodesNodal metastatic massN11 Nodea: Micrometastasis∗Micrometastases are diagnosed after sentinel lymph node biopsy and completion lymphadenectomy (if performed).b: Macrometastasis†Macrometastases are defined as clinically detectable nodal metastases confirmed by therapeutic lymphadenectomy or when nodal metastasis exhibits gross extracapsular extension.N22-3 Nodesa: Micrometastasis∗Micrometastases are diagnosed after sentinel lymph node biopsy and completion lymphadenectomy (if performed).b: Macrometastasis†Macrometastases are defined as clinically detectable nodal metastases confirmed by therapeutic lymphadenectomy or when nodal metastasis exhibits gross extracapsular extension.c: In transit met(s)/satellite(s) without metastatic nodesN3≥4 Metastatic nodes, or matted nodes, or in transit met(s)/satellite(s) with metastatic node(s)Distant metastasis (M)M0No detectable evidence of distant metastasesM1aMetastases to skin, subcutaneous, or distant lymph nodesM1bMetastases to lungM1cMetastases to all other visceral sites or distant metastases to any site combined with elevated serum LDHNote: Serum LDH is incorporated into M category as shown below:M classificationSiteSerum LDHM1aDistant skin, subcutaneous or nodal metsNormalM1bLung metastasesNormalM1cAll other visceral metastasesAny distant metastasisNormalElevatedLDH, Lactate dehydrogenase.∗ Micrometastases are diagnosed after sentinel lymph node biopsy and completion lymphadenectomy (if performed).† Macrometastases are defined as clinically detectable nodal metastases confirmed by therapeutic lymphadenectomy or when nodal metastasis exhibits gross extracapsular extension. Open table in a new tab Table III2010 American Joint Committee on Cancer anatomic stage/prognostic groupsUsed with permission of American Joint Committee on Cancer (AJCC), Chicago, IL. Original source for this material is AJCC Cancer Staging Manual, Seventh Edition (2010) published by Springer Science and Business Media LLC, www.springer.com.Clinical staging∗Clinical staging includes microstaging of primary melanoma and clinical/radiologic evaluation for metastases. By convention, it should be used after complete excision of primary melanoma with clinical assessment for regional and distant metastases.Pathologic staging†Pathologic staging includes microstaging of primary melanoma and pathologic information about regional lymph nodes after partial or complete lymphadenectomy. Patients with pathologic stage 0 or IA are the exception; they do not require pathologic evaluation of their lymph nodes.Stage 0TisN0M00TisN0M0Stage IAT1aN0M0IAT1aN0M0Stage IBT1bN0M0IBT1bN0M0T2aN0M0T2aN0M0Stage IIAT2bN0M0IIAT2bN0M0T3aN0M0T3aN0M0Stage IIBT3bN0M0IIBT3bN0M0T4aN0M0T4aN0M0Stage IICT4bN0M0IICT4bN0M0Stage IIIAny T≥N1M0IIIAT1-4aN1aM0T1-4aN2aM0IIIBT1-4bN1aM0T1-4bN2aM0T1-4aN1bM0T1-4aN2bM0T1-4aN2cM0IIICT1-4bN1bM0T1-4bN2bM0T1-4bN2cM0Any TN3M0Stage IVAny TAny NM1IVAny TAny NM1∗ Clinical staging includes microstaging of primary melanoma and clinical/radiologic evaluation for metastases. By convention, it should be used after complete excision of primary melanoma with clinical assessment for regional and distant metastases.† Pathologic staging includes microstaging of primary melanoma and pathologic information about regional lymph nodes after partial or complete lymphadenectomy. Patients with pathologic stage 0 or IA are the exception; they do not require pathologic evaluation of their lymph nodes. Open table in a new tab Although nonsurgical treatments of primary melanoma, in particular lentigo maligna, have been increasingly used in recent years, their efficacy has not been established. Suggestions on the use of these alternative treatments have been included in the current guidelines.A significant amount of data has become available on the use of sentinel lymph node (SLN) biopsy (SLNB) for melanoma since the previous guidelines. Although the procedure is not performed by dermatologists in the United States, the decision by a patient with melanoma to proceed with this staging procedure is frequently based on the advice from their dermatologist. Recommendations for the use of SLNB for primary melanoma are therefore included in the current guidelines. However, with regard to treatment recommendations, the current guidelines continue to be limited to the management of primary cutaneous melanoma. For patients with regional or distant metastases, we refer physicians to clinical practice guidelines, such as those developed by the National Comprehensive Cancer Network.1Coit D.G. Andtbacka R. Bichakjian C.K. Dilawari R.A. Dimaio D. Guild V. et al.Melanoma.J Natl Compr Canc Netw. 2009; 7: 250-275PubMed Google ScholarBiopsyThe first step for a definitive diagnosis of cancer is a biopsy that may occur by removing part of the lesion (incisional biopsy) or the entire lesion (excisional biopsy). For a lesion clinically suspicious for cutaneous melanoma, one should ideally perform a narrow excisional biopsy that encompasses the entire breadth of the lesion with clinically negative margins to a depth sufficient to ensure that the lesion is not transected.8Stell V.H. Norton H.J. Smith K.S. Salo J.C. White Jr., R.L. Method of biopsy and incidence of positive margins in primary melanoma.Ann Surg Oncol. 2007; 14: 893-898Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar, 9Karimipour D.J. Schwartz J.L. Wang T.S. Bichakjian C.K. Orringer J.S. King A.L. et al.Microstaging accuracy after subtotal incisional biopsy of cutaneous melanoma.J Am Acad Dermatol. 2005; 52: 798-802Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (27) Google Scholar, 10Austin J.R. Byers R.M. Brown W.D. Wolf P. Influence of biopsy on the prognosis of cutaneous melanoma of the head and neck.Head Neck. 1996; 18: 107-117Crossref PubMed Google Scholar, 11Ng J.C. Swain S. Dowling J.P. Wolfe R. Simpson P. Kelly J.W. The impact of partial biopsy on histopathologic diagnosis of cutaneous melanoma: experience of an Australian tertiary referral service.Arch Dermatol. 2010; 146: 234-239Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar, 12Pariser R.J. Divers A. Nassar A. The relationship between biopsy technique and uncertainty in the histopathologic diagnosis of melanoma.Dermatol Online J. 1999; 5: 4PubMed Google Scholar, 13Ng P.C. Barzilai D.A. Ismail S.A. Averitte Jr., R.L. Gilliam A.C. Evaluating invasive cutaneous melanoma: is the initial biopsy representative of the final depth?.J Am Acad Dermatol. 2003; 48: 420-424Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google Scholar, 14Armour K. Mann S. Lee S. Dysplastic nevi: to shave, or not to shave? A retrospective study of the use of the shave biopsy technique in the initial management of dysplastic nevi.Australas J Dermatol. 2005; 46: 70-75Crossref PubMed Scopus (16) Google Scholar, 15Bong J.L. Herd R.M. Hunter J.A. Incisional biopsy and melanoma prognosis.J Am Acad Dermatol. 2002; 46: 690-694Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (63) Google Scholar, 16Lederman J.S. Sober A.J. Does biopsy type influence survival in clinical stage I cutaneous melanoma?.J Am Acad Dermatol. 1985; 13: 983-987Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 17Lees V.C. Briggs J.C. Effect of initial biopsy procedure on prognosis in stage 1 invasive cutaneous malignant melanoma: review of 1086 patients.Br J Surg. 1991; 78: 1108-1110Crossref PubMed Google Scholar, 18Martin II, R.C. Scoggins C.R. Ross M.I. Reintgen D.S. Noyes R.D. Edwards M.J. et al.Is incisional biopsy of melanoma harmful?.Am J Surg. 2005; 190: 913-917PubMed Google Scholar It has been suggested that 1- to 3-mm margins are required to clear the subclinical component of most atypical melanocytic lesions.1Coit D.G. Andtbacka R. Bichakjian C.K. Dilawari R.A. Dimaio D. Guild V. et al.Melanoma.J Natl Compr Canc Netw. 2009; 7: 250-275PubMed Google Scholar, 3Australian Cancer Network, New Zealand Guidelines Group, Cancer Council Australia, New ZealandMinistry of Health. Clinical practice guidelines for the management of melanoma in Australia and New Zealand: evidence-based best practice guidelines. Australian Cancer Network, Sydney, N.S.W.2008Google Scholar, 19Rigel D.S. Friedman R. Kopf A.W. Surgical margins for the removal of dysplastic nevi.J Dermatol Surg Oncol. 1985; 11: 745Crossref Google Scholar This can be accomplished in a number of ways including elliptical or punch excision with sutures, or shave removal to a depth below the anticipated plane of the lesion. The latter is commonly used when the suspicion of melanoma is low, the lesion lends itself to complete removal by this technique, or in the setting of a macular lesion suspicious for lentigo maligna where a broad biopsy specimen may aid in histologic assessment.11Ng J.C. Swain S. Dowling J.P. Wolfe R. Simpson P. Kelly J.W. The impact of partial biopsy on histopathologic diagnosis of cutaneous melanoma: experience of an Australian tertiary referral service.Arch Dermatol. 2010; 146: 234-239Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar, 13Ng P.C. Barzilai D.A. Ismail S.A. Averitte Jr., R.L. Gilliam A.C. Evaluating invasive cutaneous melanoma: is the initial biopsy representative of the final depth?.J Am Acad Dermatol. 2003; 48: 420-424Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google ScholarClinically clear but narrow lateral margins on excisional biopsy, oriented along the longitudinal axis on extremities, will permit optimal subsequent wide local excision and, if indicated, SLNB. Incisional biopsy, with a variety of techniques noted above, of the clinically or dermatoscopically most atypical portion of the lesion, is an acceptable option in certain circumstances, such as a facial or acral location, low clinical suspicion or uncertainty of diagnosis, or a very large lesion, although the selected area may not always correlate with the deepest Breslow depth.9Karimipour D.J. Schwartz J.L. Wang T.S. Bichakjian C.K. Orringer J.S. King A.L. et al.Microstaging accuracy after subtotal incisional biopsy of cutaneous melanoma.J Am Acad Dermatol. 2005; 52: 798-802Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (27) Google Scholar If an incisional biopsy specimen is inadequate to make a histologic diagnosis or to accurately microstage the lesion for treatment planning, a repeat biopsy should be performed.9Karimipour D.J. Schwartz J.L. Wang T.S. Bichakjian C.K. Orringer J.S. King A.L. et al.Microstaging accuracy after subtotal incisional biopsy of cutaneous melanoma.J Am Acad Dermatol. 2005; 52: 798-802Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (27) Google ScholarWhen a biopsy is performed of a suspicious nail lesion (melanonychia striata, diffuse pigmentation, or amelanotic changes, eg, ulceration), the nail matrix should be sampled. Because of the complexity of nail anatomy and the fact that melanoma arises in the nail matrix, suspicious nail lesions are best evaluated and sampled by a physician skilled in the biopsy of the nail apparatus. For suspicious subungual lesions, the nail plate should be sufficiently removed to expose the underlying lesion and an excisional or incisional biopsy should be performed based on the size of the lesion. Recommendations for the use of a biopsy for primary cutaneous melanoma are summarized in Table IV. The strength of these recommendations is shown in Table V.Table IVRecommendations for biopsyPreferred biopsy technique is narrow excisional biopsy that encompasses entire breadth of lesion with clinically negative margins to depth sufficient to ensure that lesion is not transected, which may be accomplished by elliptical or punch excision with sutures, or shave removal to depth below anticipated plane of lesion.Partial sampling (incisional biopsy) is acceptable in select clinical circumstances such as facial or acral location, low clinical suspicion or uncertainty of diagnosis, or very large lesion.Repeat biopsy is recommended if initial biopsy specimen is inadequate for diagnosis or microstaging of primary lesion. Open table in a new tab Table VStrength of recommendations for management of primary cutaneous melanomaStrength of recommendationLevel of evidenceReferencesBiopsyBII8Stell V.H. Norton H.J. Smith K.S. Salo J.C. White Jr., R.L. Method of biopsy and incidence of positive margins in primary melanoma.Ann Surg Oncol. 2007; 14: 893-898Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar, 9Karimipour D.J. Schwartz J.L. Wang T.S. Bichakjian C.K. Orringer J.S. King A.L. et al.Microstaging accuracy after subtotal incisional biopsy of cutaneous melanoma.J Am Acad Dermatol. 2005; 52: 798-802Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (27) Google Scholar, 10Austin J.R. Byers R.M. Brown W.D. Wolf P. Influence of biopsy on the prognosis of cutaneous melanoma of the head and neck.Head Neck. 1996; 18: 107-117Crossref PubMed Google Scholar, 11Ng J.C. Swain S. Dowling J.P. Wolfe R. Simpson P. Kelly J.W. The impact of partial biopsy on histopathologic diagnosis of cutaneous melanoma: experience of an Australian tertiary referral service.Arch Dermatol. 2010; 146: 234-239Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar, 12Pariser R.J. Divers A. Nassar A. The relationship between biopsy technique and uncertainty in the histopathologic diagnosis of melanoma.Dermatol Online J. 1999; 5: 4PubMed Google Scholar, 13Ng P.C. Barzilai D.A. Ismail S.A. Averitte Jr., R.L. Gilliam A.C. Evaluating invasive cutaneous melanoma: is the initial biopsy representative of the final depth?.J Am Acad Dermatol. 2003; 48: 420-424Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google Scholar, 14Armour K. Mann S. Lee S. Dysplastic nevi: to shave, or not to shave? A retrospective study of the use of the shave biopsy technique in the initial management of dysplastic nevi.Australas J Dermatol. 2005; 46: 70-75Crossref PubMed Scopus (16) Google Scholar, 15Bong J.L. Herd R.M. Hunter J.A. Incisional biopsy and melanoma prognosis.J Am Acad Dermatol. 2002; 46: 690-694Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (63) Google Scholar, 16Lederman J.S. Sober A.J. Does biopsy type influence survival in clinical stage I cutaneous melanoma?.J Am Acad Dermatol. 1985; 13: 983-987Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 17Lees V.C. Briggs J.C. Effect of initial biopsy procedure on prognosis in stage 1 invasive cutaneous malignant melanoma: review of 1086 patients.Br J Surg. 1991; 78: 1108-1110Crossref PubMed Google Scholar, 18Martin II, R.C. Scoggins C.R. Ross M.I. Reintgen D.S. Noyes R.D. Edwards M.J. et al.Is incisional biopsy of melanoma harmful?.Am J Surg. 2005; 190: 913-917PubMed Google ScholarPathology report: Clinical informationAI-II20Corona R. Scio M. Mele A. Ferranti G. Mostaccioli S. Macchini V. et al.Survival and prognostic factors in patients with localized cutaneous melanoma observed between 1980 and 1991 at the Istituto Dermopatico dell’Immacolata in Rome, Italy.Eur J Cancer. 1994; 30A: 333-338Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (13) Google Scholar, 21Mansson-Brahme E. Carstensen J. Erhardt K. Lagerlof B. Ringborg U. Rutqvist L.E. Prognostic factors in thin cutaneous malignant melanoma.Cancer. 1994; 73: 2324-2332Crossref PubMed Google Scholar, 22Schuchter L. Schultz D.J. Synnestvedt M. Trock B.J. Guerry D. Elder D.E. et al.A prognostic model for predicting 10-year survival in patients with primary melanoma: the pigmented lesion group.Ann Intern Med. 1996; 125: 369-375Crossref PubMed Google Scholar, 23Halpern A.C. Schuchter L.M. Prognostic models in melanoma.Semin Oncol. 1997; 24: S2-S7PubMed Google Scholar, 24Gimotty P.A. Guerry D. Ming M.E. Elenitsas R. Xu X. Czerniecki B. et al.Thin primary cutaneous malignant melanoma: a prognostic tree for 10-year metastasis is more accurate than American Joint Committee on Cancer staging.J Clin Oncol. 2004; 22: 3668-3676Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 25Massi D. Franchi A. Borgognoni L. Reali U.M. Santucci M. Thin cutaneous malignant melanomas (< or =1.5 mm): identification of risk factors indicative of progression.Cancer. 1999; 85: 1067-1076Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 26Francken A.B. Shaw H.M. Thompson J.F. Soong S.J. Accortt N.A. Azzola M.F. et al.The prognostic importance of tumor mitotic rate confirmed in 1317 patients with primary cutaneous melanoma and long follow-up.Ann Surg Oncol. 2004; 11: 426-433Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 27Nagore E. Oliver V. Botella-Estrada R. Moreno-Picot S. Insa A. Fortea J.M. Prognostic factors in localized invasive cutaneous melanoma: high value of mitotic rate, vascular invasion and microscopic satellitosis.Melanoma Res. 2005; 15: 169-177Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar, 28Leiter U. Buettner P.G. Eigentler T.K. Garbe C. Prognostic factors of thin cutaneous melanoma: an analysis of the central malignant melanoma registry of the German Dermatological Society.J Clin Oncol. 2004; 22: 3660-3667Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 29Cochran A.J. Elashoff D. Morton D.L. Elashoff R. Individualized prognosis for melanoma patients.Hum Pathol. 2000; 31: 327-331Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 30Balch C.M. Soong S. Ross M.I. Urist M.M. Karakousis C.P. Temple W.J. et al.Long-term results of a multi-institutional randomized trial comparing prognostic factors and surgical results for intermediate thickness melanomas (1.0 to 4.0 mm): intergroup melanoma surgical trial.Ann Surg Oncol. 2000; 7: 87-97Crossref PubMed Google Scholar, 31Levi F. Randimbison L. La Vecchia C. Te V.C. Franceschi S. Prognostic factors for cutaneous malignant melanoma in Vaud, Switzerland.Int J Cancer. 1998; 78: 315-319Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar, 32Sahin S. Rao B. Kopf A.W. Lee E. Rigel D.S. Nossa R. et al.Predicting ten-year survival of patients with primary cutaneous melanoma: corroboration of a prognostic model.Cancer. 1997; 80: 1426-1431Crossref PubMed Scopus (57) Google Scholar, 33Straume O. Akslen L.A. Independent prognostic importance of vascular invasion in nodular melanomas.Cancer. 1996; 78: 1211-1219Crossref PubMed Scopus (40) Google Scholar, 34Eldh J. Boeryd B. Peterson L.E. Prognostic factors in cutane

Extant evidence implicates growth factor signaling in the pathogenesis of many tumor types, including cutaneous melanoma. Recently, reciprocal activating mutations of NRAS and BRAF were found in benign melanocytic nevi and cutaneous melanomas. We had previously reported a similar epistatic relationship between activating NRAS mutations and inactivating PTEN/MMAC1 alterations. We thus hypothesized that BRAF and PTEN/MMAC1 mutations may cooperate to promote melanoma tumorigenesis. Overall, 40 of 47 (85%) melanoma cell lines and 11 of 16 (69%) uncultured melanoma metastases had mutations in NRAS, BRAF, or PTEN/MMAC1. NRAS was exclusively mutated in nine of 47 (19%) cell lines and two of 16 (13%) metastases, whereas BRAF was solely mutated in 28 of 47 (60%) cell lines and nine of 16 (56%) metastases. In the 12 of 15 melanoma cell lines (80%) and two of two melanoma metastases with PTEN alterations, BRAF was also mutated. These findings suggest the existence of possible cooperation between BRAF activation and PTEN loss in melanoma development. Extant evidence implicates growth factor signaling in the pathogenesis of many tumor types, including cutaneous melanoma. Recently, reciprocal activating mutations of NRAS and BRAF were found in benign melanocytic nevi and cutaneous melanomas. We had previously reported a similar epistatic relationship between activating NRAS mutations and inactivating PTEN/MMAC1 alterations. We thus hypothesized that BRAF and PTEN/MMAC1 mutations may cooperate to promote melanoma tumorigenesis. Overall, 40 of 47 (85%) melanoma cell lines and 11 of 16 (69%) uncultured melanoma metastases had mutations in NRAS, BRAF, or PTEN/MMAC1. NRAS was exclusively mutated in nine of 47 (19%) cell lines and two of 16 (13%) metastases, whereas BRAF was solely mutated in 28 of 47 (60%) cell lines and nine of 16 (56%) metastases. In the 12 of 15 melanoma cell lines (80%) and two of two melanoma metastases with PTEN alterations, BRAF was also mutated. These findings suggest the existence of possible cooperation between BRAF activation and PTEN loss in melanoma development. Sustained growth factor signaling is a critical step in the evolution of cutaneous melanoma. In vitro, basic fibroblast growth factor can form an autocrine stimulatory loop (Meier et al., 2000Meier F. Nesbit M. Hsu M.Y. et al.Human melanoma progression in skin reconstructs: Biological significance of bFGF.Am J Pathol. 2000; 156: 193-200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (175) Google Scholar;Graeven et al., 2001Graeven U. Rodeck U. Karpinski S. Jost M. Philippou S. Schmiegel W. Modulation of angiogenesis and tumorigenicity of human melanocytic cells by vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor.Cancer Res. 2001; 61: 7282-7290PubMed Google Scholar), whereas in vivo, transgenic expression of the receptor tyrosine kinase, RET (Iwamoto et al., 1991Iwamoto T. Takahashi M. Ito M. et al.Aberrant melanogenesis and melanocytic tumour development in transgenic mice that carry a metallothionein/ret fusion gene.EMBO J. 1991; 10: 3167-3175PubMed Google Scholar;Kato et al., 1998Kato M. Takahashi M. Akhand A.A. et al.Transgenic mouse model for skin malignant melanoma.Oncogene. 1998; 17: 1885-1888Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar), leads to melanocytic tumors. Post-receptor, activating RAS mutations have also been reported in a significant proportion of cutaneous melanomas (Herlyn and Satyamoorthy, 1996Herlyn M. Satyamoorthy K. Activated ras: Yet another player in melanoma?.Am J Pathol. 1996; 149: 739-744PubMed Google Scholar;van Elsas et al., 1996van Elsas A. Zerp S.F. van der Flier S. et al.Relevance of ultraviolet-induced Nras oncogene point mutations in development of primary human cutaneous melanoma.Am J Pathol. 1996; 149: 883-893PubMed Google Scholar). Two distinct RAS signaling streams—the RAS/RAF/MAPK and the RAS/PI3-K/PTEN/AKT pathways—have both been shown to be activated in primary melanomas (Cohen et al., 2002Cohen C. Zavala-Pompa A. Sequeira J.H. et al.Mitogen-activated protein kinase activation is an early event in melanoma progression.Clin Cancer Res. 2002; 8: 3728-3733PubMed Google Scholar;Dhawan et al., 2002Dhawan P. Singh A.B. Ellis D.L. Richmond A. Constitutive activation of Akt/protein kinase B in melanoma leads to up-regulation of nuclear factor-kappaB and tumor progression.Cancer Res. 2002; 62: 7335-7342PubMed Google Scholar;Govindarajan et al., 2003Govindarajan B. Bai X. Cohen C. et al.Malignant transformation of melanocytes to melanoma by constitutive activation of mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK) signaling.J Biol Chem. 2003; 278: 9790-9795Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar;Satyamoorthy et al., 2003Satyamoorthy K. Li G. Gerrero M.R. et al.Constitutive mitogen-activated protein kinase activation in melanoma is mediated by both BRAF mutations and autocrine growth factor stimulation.Cancer Res. 2003; 63: 756-759PubMed Google Scholar). Moreover, BRAF, which is a component of the RAS/RAF/MAPK signaling cassette, was recently found to be mutated in 60% to 80% of cutaneous melanomas and benign melanocytic nevi (Davies et al., 2002Davies H. Bignell G.R. Cox C. et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer.Nature. 2002; 417: 949-954Crossref PubMed Scopus (7605) Google Scholar;Pollock et al., 2003Pollock P.M. Harper U.L. Hansen K.S. et al.High frequency of BRAF mutations in nevi.Nat Genet. 2003; 33: 19-20Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar). Taken together, the RAS signaling network represents a rich source of oncogenic events. We had previously demonstrated a reciprocal relationship between NRAS activation and PTEN/MMAC1 inactivation in melanoma cell lines and uncultured specimens (Tsao et al., 2000Tsao H. Zhang X. Fowlkes K. Haluska F.G. Relative reciprocity of NRAS and PTEN/MMAC1 alterations in cutaneous melanoma cell lines.Cancer Res. 2000; 60: 1800-1804PubMed Google Scholar). As RAS directly stimulates PI3-K (Rodriguez-Viciana et al., 1996Rodriguez-Viciana P. Marte B.M. Warne P.H. Downward J. Phosphatidylinositol 3′ kinase: One of the effectors of Ras.Philos Trans R Soc London B Biol Sci. 1996; 351 (discussion 231–222): 225-231Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar,Rodriguez-Viciana et al., 1997Rodriguez-Viciana P. Warne P.H. Khwaja A. et al.Role of phosphoinositide 3-OH kinase in cell transformation and control of the actin cytoskeleton by Ras.Cell. 1997; 89: 457-467Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (928) Google Scholar) and PTEN attenuates PI3-K signaling (Maehama and Dixon, 1998Maehama T. Dixon J.E. The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate.J Biol Chem. 1998; 273: 13375-13378Crossref PubMed Scopus (2481) Google Scholar;Wu et al., 1998Wu X. Senechal K. Neshat M.S. Whang Y.E. Sawyers C.L. The PTEN/MMAC1 tumor suppressor phosphatase functions as a negative regulator of the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway.Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 15587-15591Crossref PubMed Scopus (585) Google Scholar), reciprocal NRAS and PTEN/MMAC1 alterations may contribute to the heightened AKT activity observed in melanomas (Dhawan et al., 2002Dhawan P. Singh A.B. Ellis D.L. Richmond A. Constitutive activation of Akt/protein kinase B in melanoma leads to up-regulation of nuclear factor-kappaB and tumor progression.Cancer Res. 2002; 62: 7335-7342PubMed Google Scholar). As loss of PTEN protein expression occurs in 63% of primary melanomas and only 8% of nevi (Tsao et al., 2003Tsao H. Mihm M.C. Sheehan C. PTEN expression in normal skin, acquired melanocytic nevi and cutaneous melanoma.J Am Acad Dermatol. 2003; 49: 865-872Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (88) Google Scholar), inactivation of PTEN/MMAC1 may be a feature of progression from melanocytic nevi to primary melanoma. Likewise, a similar epistatic relationship between oncogenic alleles of NRAS and BRAF has also been described (Davies et al., 2002Davies H. Bignell G.R. Cox C. et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer.Nature. 2002; 417: 949-954Crossref PubMed Scopus (7605) Google Scholar;Pollock et al., 2003Pollock P.M. Harper U.L. Hansen K.S. et al.High frequency of BRAF mutations in nevi.Nat Genet. 2003; 33: 19-20Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar). As RAS activates RAF leading to MAPK stimulation (Campbell et al., 1998Campbell S.L. Khosravi-Far R. Rossman K.L. Clark G.J. Der C.J. Increasing complexity of Ras signaling.Oncogene. 1998; 17: 1395-1413Crossref PubMed Scopus (898) Google Scholar), reciprocal NRAS and BRAF mutations may account for the increased MAPK activity reported for melanoma (Cohen et al., 2002Cohen C. Zavala-Pompa A. Sequeira J.H. et al.Mitogen-activated protein kinase activation is an early event in melanoma progression.Clin Cancer Res. 2002; 8: 3728-3733PubMed Google Scholar;Govindarajan et al., 2003Govindarajan B. Bai X. Cohen C. et al.Malignant transformation of melanocytes to melanoma by constitutive activation of mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK) signaling.J Biol Chem. 2003; 278: 9790-9795Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar;Satyamoorthy et al., 2003Satyamoorthy K. Li G. Gerrero M.R. et al.Constitutive mitogen-activated protein kinase activation in melanoma is mediated by both BRAF mutations and autocrine growth factor stimulation.Cancer Res. 2003; 63: 756-759PubMed Google Scholar). The genetic relationship described for NRAS, BRAF, and PTEN/MMAC1 raises the possibility that BRAF activation and PTEN/MMAC1 inactivation cooperate to simulate NRAS activation in order to promote melanoma tumorigenesis. To test this hypothesis directly, we screened for BRAF mutations in a series of melanoma samples whose NRAS and PTEN/MMAC1 had been previously characterized and found evidence for possible cooperation between BRAF and PTEN/MMAC1. Using PCR–single strand conformation polymorphism, we evaluated 47 melanoma cell lines and 16 uncultured metastatic melanoma specimens for mutations in exons 11 and 15 of BRAF. Whereas no exon 11 amplicons exhibited altered migration, multiple exon 15 amplicons demonstrated mobility shifts suggestive of sequence variants Figure 1a. After direct sequencing, we found that 28 of 47 (62%) melanoma lines harbored mutations at valine599– 26 lines had the canonical T1796A (BRAFV599E) mutation, whereas two lines harbored the TG1796-97AT (BRAFV599D) mutation. The BRAFV599E mutation was also present in nine of 16 (56%) uncultured metastatic melanoma specimens. In three of 28 melanoma cell lines with BRAFV599 mutations, the normal BRAF allele was deleted Figure 1a, b. Although loss of heterozygosity is typically a signature of a tumor suppressor locus, shedding of the wild-type allele has been described for NRAS (Osaka et al., 1997Osaka M. Matsuo S. Koh T. Sugiyama T. Loss of heterozygosity at the N-ras locus in 7,12-dimethylbenz[a] anthracene-induced rat leukemia.Mol Carcinog. 1997; 18: 206-212Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar), KRAS (Sukumar et al., 1991Sukumar S. Armstrong B. Bruyntjes J.P. Leav I. Bosland M.C. Frequent activation of the Ki-ras oncogene at codon 12 in N-methyl-N-nitrosourea-induced rat prostate adenocarcinomas and neurogenic sarcomas.Mol Carcinog. 1991; 4: 362-368Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar), and HRAS (Saranath et al., 1991Saranath D. Chang S.E. Bhoite L.T. et al.High frequency mutation in codons 12 and 61 of H-ras oncogene in chewing tobacco-related human oral carcinoma in India.Br J Cancer. 1991; 63: 573-578Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). As the BRAFV599 alterations are presumably gain-of-function mutations, the normal allele would represent a hypo-functional competitor whose loss could potentiate the effectiveness of the BRAFV599 variant. Alternatively,Diaz et al., 2002Diaz R. Ahn D. Lopez-Barcons L. et al.The N-ras proto-oncogene can suppress the malignant phenotype in the presence or absence of its oncogene.Cancer Res. 2002; 62: 4514-4518PubMed Google Scholar, recently found that the presence of a wild-type NRAS allele impedes the formation of murine lymphomas in vivo and suppresses the malignant phenotype in vitro; thus, it is conceivable that the BRAF proto-oncogene may exhibit tumor suppressive properties under certain biologic contexts. The NRAS, BRAF, and PTEN/MMAC1 status for the various cell lines and specimens are shown in Table I and Table II. Overall, 40 of 47 (85%) melanoma cell lines and 11 of 16 (69%) uncultured melanoma metastases had mutations in at least one of the three loci. Several observations emerged from our analysis. First, NRAS was solely mutated in nine melanoma cell lines and two uncultured melanoma specimens, although there was one additional cell line that exhibited concurrent NRAS and PTEN/MMAC1 alterations (i.e., HS944;Tsao et al., 2000Tsao H. Zhang X. Fowlkes K. Haluska F.G. Relative reciprocity of NRAS and PTEN/MMAC1 alterations in cutaneous melanoma cell lines.Cancer Res. 2000; 60: 1800-1804PubMed Google Scholar). Second, 15 cell lines and two uncultured metastases exhibited either PTEN/MMAC1 mutations (11 lines, both metastases) or loss of protein expression (four lines, Table I); epigenetic silencing of PTEN/MMAC1 has been reported in cutaneous melanoma (Zhou et al., 2000Zhou X.P. Gimm O. Hampel H. Niemann T. Walker M.J. Eng C. Epigenetic PTEN silencing in malignant melanomas without PTEN mutation.Am J Pathol. 2000; 157: 1123-1128Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (227) Google Scholar). Of the 63 samples analyzed, BRAF was mutated in 12 of 15 (80%) and two of two (100%) of the PTEN-deficient lines and metastatic specimens, respectively (p=0.02, two-tailed Fisher exact test). An additional 16 melanoma lines and seven uncultured metastases displayed BRAF mutations without either NRAS or PTEN/MMAC1 participation. Finally, two melanoma lines showed PTEN/MMAC1 inactivation without BRAF involvement.Table IBRAF, NRAS, and PTEN/MMAC1 mutations in melanoma cell linesNRASaNRAS, PTEN/MMAC1 status on some cell lines published inTsao et al (2000).PTEN/MMAC1BRAF exon 15Cell lineMutationEffectMutationEffectMutationEffectMGH-MC-2G35AG12DwtWTwtWTMel-SwiftC180AQ61KwtWTwtWTMGH-PO-1C180AQ61KwtWTwtWTSK Mel-l19A181GQ61RwtWTwtWTSK Mel-30C180AQ61KwtWTwtWTMel JusoA181TQ61LwtWTwtWTK19C180AQ61KwtWTwtWTHS940A181GQ61RwtWTwtWTSK Mel 63C180AQ61KwtWTwtWTHS944C180AQ61KDel exon2Frameshift/premature stopwtWTSK Mel 39wtWT546insAFrameshift/premature stopT1796AV599EMGH-BO-1wtWTDel exon2Frameshift/premature stopT1796AV599ESk Mel37wtWTDel exon 2Frameshift/premature stopT1796AV599EUACC 903wtWTT226GTyr 76 StopT1796AV599ERUwtWTIVS3del+1→+4Possible splice variantT1796AV599EMM455wtWTDel exon 6Frameshift/premature stopT1796AV599ESK Mel 28wtWTA499GT167AT1796AbBoth alleles show 599E.599ESK Mel 131wtWTIVS5+2T→APossible splice variantT1796AV599EMEL-11wtWTwtNo proteincNo protein by western.T1796AV599EWM1158wtWTwtNo proteincNo protein by western.T1796AV599EWM239AwtWTwtNo proteincNo protein by western.TG1796–97ATV599DWM1799wtWTFailed PCRNo proteincNo protein by western.T1796AV599ESK Mel 23wtWTDel geneNo predicted productwtWTMLwtWTDel geneNo predicted productwtWTMGH-MC-1wtWTwtWTT1796AV599EK1-MelwtWTwtWTT1796AV599EMEL-31wtWTwtWTT1796AV599EWM164wtWTwtWTT1796AV599EMH-12wtWTwtWTTG1796–97ATV599DMH-2wtWTwtWTT1796AV599EK-16wtWTwtWTT1796AV599EA375wtWTwtWTT1796AbBoth alleles show 599E.599EHS939TwtWTwtWTT1796AV599EMH-17wtWTwtWTT1796AV599EMalmewtWTwtWTT1796AV599EK4wtWTwtWTT1796AV599ESteelewtWTwtWTT1796AV599EK2wtWTwtWTT1796AV599EWM115wtWTwtWTT1796AV599EMM608wtWTwtWTT1796AbBoth alleles show 599E.599Ea NRAS, PTEN/MMAC1 status on some cell lines published inTsao et al., 2000Tsao H. Zhang X. Fowlkes K. Haluska F.G. Relative reciprocity of NRAS and PTEN/MMAC1 alterations in cutaneous melanoma cell lines.Cancer Res. 2000; 60: 1800-1804PubMed Google Scholar.b Both alleles show 599E.c No protein by western. Open table in a new tab Table IIBRAF, NRAS, and PTEN/MMAC1 mutationsaPTEN/MMAC1 and NRAS genetic status reported inTsao et al (1998,2000). ROH: retention of heterozygosity. in melanoma metastasesNRASPTEN/MMAC1BRAF Exon 15Cutaneous melanoma specimensMutationEffectMutationEffectMutationEffect30A181GQ61RwtWTwtWT7A181GQ61RwtWTwtWT31 (KM16)wtWTROHHDT1796AV599E33 (KM17)wtWT1591 DupFrameshiftT1796AV599E(nt1575–1591)271 stop6wtWTwtWTT1796AV599E8wtWTwtWTT1796AV599E16wtWTwtWTT1796AV599E22wtWTwtWTT1796AV599E24wtWTwtWTT1796AV599E25wtWTwtWTT1796AV599E28wtWTwtWTT1796AV599E4wtWTwtWTwtWT15wtWTwtWTwtWT12wtWTwtWTwtWT9wtWTwtWTwtWT10wtWTwtWTwtWTa PTEN/MMAC1 and NRAS genetic status reported inTsao et al., 1998Tsao H. Zhang X. Benoit E. Haluska F.G. Identification of PTEN/MMAC1 alterations in uncultured melanomas and melanoma cell lines.Oncogene. 1998; 16: 3397-3402Crossref PubMed Scopus (195) Google Scholar,Tsao et al., 2000Tsao H. Zhang X. Fowlkes K. Haluska F.G. Relative reciprocity of NRAS and PTEN/MMAC1 alterations in cutaneous melanoma cell lines.Cancer Res. 2000; 60: 1800-1804PubMed Google Scholar. ROH: retention of heterozygosity. Open table in a new tab We report, for the first time that, in a subset of melanomas, BRAF activation accompanies PTEN/MMAC1 inactivation to the mutual exclusion of NRAS mutations. These results suggest that (1) BRAF and PTEN/MMAC1 operate on distinct genetic pathways and could cooperate to promote melanoma tumorigenesis, and (2) a single NRAS mutation, albeit not as common as alterations in either BRAF or PTEN/MMAC1, may be sufficient (model shown in Figure 2). As BRAF and PTEN selectively impact the MAPK and AKT pathways, respectively, activation of both signaling streams may be required for melanoma progression. Cohen et al., 2002Cohen C. Zavala-Pompa A. Sequeira J.H. et al.Mitogen-activated protein kinase activation is an early event in melanoma progression.Clin Cancer Res. 2002; 8: 3728-3733PubMed Google Scholar, found that over 80% of primary cutaneous melanomas, but only 20% of benign nevi, expressed active phosphoMAPK.Satyamoorthy et al., 2003Satyamoorthy K. Li G. Gerrero M.R. et al.Constitutive mitogen-activated protein kinase activation in melanoma is mediated by both BRAF mutations and autocrine growth factor stimulation.Cancer Res. 2003; 63: 756-759PubMed Google Scholar, also reported that vertical growth phase and metastatic melanomas, but not benign nevi, stained intensely for active phosphoERK and that the ERK phosphorylation in melanoma cell lines was abrogated by the MEK inhibitor PD98059. With respect to the AKT pathway,Dhawan et al., 2002Dhawan P. Singh A.B. Ellis D.L. Richmond A. Constitutive activation of Akt/protein kinase B in melanoma leads to up-regulation of nuclear factor-kappaB and tumor progression.Cancer Res. 2002; 62: 7335-7342PubMed Google Scholar, found increased staining for active phosphoAKT in metastatic melanoma specimens but not benign nevi and observed loss of AKT phosphorylation in melanoma cell lines exposed to PI3-K inhibitors, LY294002 and wortmannin. These data, along with our findings, point to an essential role for ongoing trophic signaling, through both MAPK and AKT pathways. The high rate of BRAF mutations in nevi (Pollock et al., 2003Pollock P.M. Harper U.L. Hansen K.S. et al.High frequency of BRAF mutations in nevi.Nat Genet. 2003; 33: 19-20Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar;Uribe et al., 2003Uribe P. Wistuba I.I. Gonzalez S. BRAF mutation: A frequent event in benign, atypical, and malignant melanocytic lesions of the skin.Am J Dermatopathol. 2003; 25: 365-370Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar) implies that the MAPK pathway is genetically engaged early in melanocytic tumor formation but is insufficient to induce full malignant transformation; other events are clearly necessary for progression. We recently found that 19 of 30 (63%) primary melanomas demonstrated significant decreases in PTEN levels, although only three of 39 melanocytic nevi (8%) exhibited loss of PTEN expression (Tsao et al., 2003Tsao H. Mihm M.C. Sheehan C. PTEN expression in normal skin, acquired melanocytic nevi and cutaneous melanoma.J Am Acad Dermatol. 2003; 49: 865-872Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (88) Google Scholar); these results parallel other observations that active phosphoAKT can be detected in melanomas but not in melanocytic nevi (Dhawan et al., 2002Dhawan P. Singh A.B. Ellis D.L. Richmond A. Constitutive activation of Akt/protein kinase B in melanoma leads to up-regulation of nuclear factor-kappaB and tumor progression.Cancer Res. 2002; 62: 7335-7342PubMed Google Scholar). Thus, unlike BRAF activation, PTEN loss appears to be more specific for melanoma tumorigenesis. Taken together, one hypothesis that emerges is that loss of PTEN cooperates with activation of BRAF in the transition from nevus to melanoma. The high BRAF mutation rate, especially in melanoma, raises the possibility of an effective anti-BRAF therapy. As our data document a significant rate of concurrent mutations in the RAS/PI3-VK/PTEN/AKT pathway, monotherapy targeted at BRAF alone may be ineffectual. Further studies will obviously be necessary in order to optimize rationale drug design. In summary, we have identified a potential genetic interaction between three components of the RAS signaling network—NRAS, BRAF, and PTEN/MMAC1. Based on the known cellular functions of these respective gene products, the pattern of mutations suggest that the MAPK and AKT pathways are frequently activated in parallel, by genetic means, to promote melanoma development. The human melanoma cell lines, culture conditions, uncultured melanoma specimens, and their NRAS and PTEN/MMAC1 status have been described previously (Tsao et al., 2000Tsao H. Zhang X. Fowlkes K. Haluska F.G. Relative reciprocity of NRAS and PTEN/MMAC1 alterations in cutaneous melanoma cell lines.Cancer Res. 2000; 60: 1800-1804PubMed Google Scholar). All studies were done in accordance with a protocol approved by the IRB at the Massachusetts General Hospital. Primer sequences for the exons 11 and 15 of BRAF are published (Davies et al., 2002Davies H. Bignell G.R. Cox C. et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer.Nature. 2002; 417: 949-954Crossref PubMed Scopus (7605) Google Scholar). Amplification was carried out in 50 μL reaction containing 1 μL of DNA, 1.5 mM MgCl2 and 40 ng of each primer under standard conditions with or without 0.25 μL of [α32P]deoxycytidine triphosphate (NEN, Boston, Massachusetts). The samples were initially denatured at 95°C 5 min, than amplified for 35 cycles of 95°C 1 min, 62°C 1.5 min, 72°C 1.5 min, and final extension at 72°C for 10 min. The PCR product was confirmed on 1.2% agarose gel. Ten microliters of PCR product was then mixed with 10 μL of the gel loading buffer (95% formamide, 10 mM EDTA, 0.02% bromophenol blue and 0.02% xylene cyanol FF) and the samples were denatured at 95°C for 5 min and chilled immediately for 5 min. The sample was loaded on to 6% acrylamide gel containing 10% glycerol, 1×TBE pH 8.0. The gel was run in 0.6×TBE at 5–6 W at 4°C for 5 to 6 h. The gel was either stained with a silver staining kit (DNA Silver Staining Kit, Amersham/Pharmacia, Uppsala, Sweden) or exposed to X-ray film (Biomax-MR, Kodak, Rochester, New York), if radioactivity was used. DNA fragments showing mobility shifts were than prepared by PCR under the same condition, purified using Qiaquick PCR purification kit per manufacturer's protocol (Qiagen Inc., Valencia, California) and submitted to Massachusetts General Hospital sequencing core facility for automated sequencing. Whole cell lysate was prepared from the melanoma cell lines using RIPA buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8.0, 1% nonidet P40, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 0.5% sodium deoxycholate, 5 μg per mL each of aprotinin and leupeptin and 1 mM of phenylmethylsulfonyl fluoride) containing the cocktail of protease inhibitors (Roche Molecular Biology). Fifty micrograms of protein were loaded on to sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis gel and transferred on to nitrocellulose paper. The blot was incubated with an anti-PTEN monoclonal antibody at 1:1000 (A2B1, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California). After washing, incubating with secondary antibody (sheep anti-mouse horseradish peroxidase; Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey), the blot was developed with chemiluminescent substrate. This work was funded in part through grants from the American Cancer Society, Dermatology Foundation, the American Skin Cancer (to H.T.) and the National Institutes of Health (to H.T. and F.G.H.)

So far, two genes associated with familial melanoma have been identified, accounting for a minority of genetic risk in families. Mutations in CDKN2A account for approximately 40% of familial cases, and predisposing mutations in CDK4 have been reported in a very small number of melanoma kindreds. Here we report the whole-genome sequencing of probands from several melanoma families, which we performed in order to identify other genes associated with familial melanoma. We identify one individual carrying a novel germline variant (coding DNA sequence c.G1075A; protein sequence p.E318K; rs149617956) in the melanoma-lineage-specific oncogene microphthalmia-associated transcription factor (MITF). Although the variant co-segregated with melanoma in some but not all cases in the family, linkage analysis of 31 families subsequently identified to carry the variant generated a log of odds (lod) score of 2.7 under a dominant model, indicating E318K as a possible intermediate risk variant. Consistent with this, the E318K variant was significantly associated with melanoma in a large Australian case-control sample. Likewise, it was similarly associated in an independent case-control sample from the United Kingdom. In the Australian sample, the variant allele was significantly over-represented in cases with a family history of melanoma, multiple primary melanomas, or both. The variant allele was also associated with increased naevus count and non-blue eye colour. Functional analysis of E318K showed that MITF encoded by the variant allele had impaired sumoylation and differentially regulated several MITF targets. These data indicate that MITF is a melanoma-predisposition gene and highlight the utility of whole-genome sequencing to identify novel rare variants associated with disease susceptibility.

Abstract GenoMEL, comprising major familial melanoma research groups from North America, Europe, Asia, and Australia has created the largest familial melanoma sample yet available to characterize mutations in the high-risk melanoma susceptibility genes CDKN2A/alternate reading frames (ARF), which encodes p16 and p14ARF, and CDK4 and to evaluate their relationship with pancreatic cancer (PC), neural system tumors (NST), and uveal melanoma (UM). This study included 466 families (2,137 patients) with at least three melanoma patients from 17 GenoMEL centers. Overall, 41% (n = 190) of families had mutations; most involved p16 (n = 178). Mutations in CDK4 (n = 5) and ARF (n = 7) occurred at similar frequencies (2-3%). There were striking differences in mutations across geographic locales. The proportion of families with the most frequent founder mutation(s) of each locale differed significantly across the seven regions (P = 0.0009). Single founder CDKN2A mutations were predominant in Sweden (p.R112_L113insR, 92% of family's mutations) and the Netherlands (c.225_243del19, 90% of family's mutations). France, Spain, and Italy had the same most frequent mutation (p.G101W). Similarly, Australia and United Kingdom had the same most common mutations (p.M53I, c.IVS2-105A&gt;G, p.R24P, and p.L32P). As reported previously, there was a strong association between PC and CDKN2A mutations (P &lt; 0.0001). This relationship differed by mutation. In contrast, there was little evidence for an association between CDKN2A mutations and NST (P = 0.52) or UM (P = 0.25). There was a marginally significant association between NST and ARF (P = 0.05). However, this particular evaluation had low power and requires confirmation. This GenoMEL study provides the most extensive characterization of mutations in high-risk melanoma susceptibility genes in families with three or more melanoma patients yet available. (Cancer Res 2006; 66(20): 9818-28)

Background: The major factors individually reported to be associated with an increased frequency of CDKN2A mutations are increased number of patients with melanoma in a family, early age at melanoma diagnosis, and family members with multiple primary melanomas (MPM) or pancreatic cancer. Methods: These four features were examined in 385 families with ⩾3 patients with melanoma pooled by 17 GenoMEL groups, and these attributes were compared across continents. Results: Overall, 39% of families had CDKN2A mutations ranging from 20% (32/162) in Australia to 45% (29/65) in North America to 57% (89/157) in Europe. All four features in each group, except pancreatic cancer in Australia (p = 0.38), individually showed significant associations with CDKN2A mutations, but the effects varied widely across continents. Multivariate examination also showed different predictors of mutation risk across continents. In Australian families, ⩾2 patients with MPM, median age at melanoma diagnosis ⩽40 years and ⩾6 patients with melanoma in a family jointly predicted the mutation risk. In European families, all four factors concurrently predicted the risk, but with less stringent criteria than in Australia. In North American families, only ⩾1 patient with MPM and age at diagnosis ⩽40 years simultaneously predicted the mutation risk. Conclusions: The variation in CDKN2A mutations for the four features across continents is consistent with the lower melanoma incidence rates in Europe and higher rates of sporadic melanoma in Australia. The lack of a pancreatic cancer–CDKN2A mutation relationship in Australia probably reflects the divergent spectrum of mutations in families from Australia versus those from North America and Europe. GenoMEL is exploring candidate host, genetic and/or environmental risk factors to better understand the variation observed.

Kinase inhibitors constitute an important new class of cancer drugs, whose selective efficacy is largely determined by underlying tumor cell genetics. We established a high-throughput platform to profile 500 cell lines derived from diverse epithelial cancers for sensitivity to 14 kinase inhibitors. Most inhibitors were ineffective against unselected cell lines but exhibited dramatic cell killing of small nonoverlapping subsets. Cells with exquisite sensitivity to EGFR, HER2, MET, or BRAF kinase inhibitors were marked by activating mutations or amplification of the drug target. Although most cell lines recapitulated known tumor-associated genotypes, the screen revealed low-frequency drug-sensitizing genotypes in tumor types not previously associated with drug susceptibility. Furthermore, comparing drugs thought to target the same kinase revealed striking differences, predictive of clinical efficacy. Genetically defined cancer subsets, irrespective of tissue type, predict response to kinase inhibitors, and provide an important preclinical model to guide early clinical applications of novel targeted inhibitors.

Background BAP1 has been shown to be a target of both somatic alteration in high-risk ocular melanomas (OM) and germline inactivation in a few individuals from cancer-prone families. These findings suggest that constitutional BAP1 changes may predispose individuals to metastatic OM and that familial permeation of deleterious alleles could delineate a new cancer syndrome. Design To characterize BAP1's contribution to melanoma risk, we sequenced BAP1 in a set of 100 patients with OM, including 50 metastatic OM cases and 50 matched non-metastatic OM controls, and 200 individuals with cutaneous melanoma (CM) including 7 CM patients from CM-OM families and 193 CM patients from CM-non-OM kindreds. Results Germline BAP1 mutations were detected in 4/50 patients with metastatic OM and 0/50 cases of non-metastatic OM (8% vs. 0%, p = 0.059). Since 2/4 of the BAP1 carriers reported a family history of CM, we analyzed 200 additional hereditary CM patients and found mutations in 2/7 CM probands from CM-OM families and 1/193 probands from CM-non-OM kindreds (29% vs. 0.52%, p = .003). Germline mutations co-segregated with both CM and OM phenotypes and were associated with the presence of unique nevoid melanomas and highly atypical nevoid melanoma-like melanocytic proliferations (NEMMPs). Interestingly, 7/14 germline variants identified to date reside in C-terminus suggesting that the BRCA1 binding domain is important in cancer predisposition. Conclusion Germline BAP1 mutations are associated with a more aggressive OM phenotype and a recurrent phenotypic complex of cutaneous/ocular melanoma, atypical melanocytic proliferations and other internal neoplasms (ie. COMMON syndrome), which could be a useful clinical marker for constitutive BAP1 inactivation.

Traditionally, genetic studies in cancer are focused on somatic mutations found in tumors and absent from the normal tissue. Identification of shared attributes in germline variation could aid discrimination of high-risk from likely benign mutations and narrow the search space for new cancer predisposing genes. Extraordinary progress made in analysis of common variation with GWAS methodology does not provide sufficient resolution to understand rare variation. To fulfill missing classification for rare germline variation we assembled datasets of whole exome sequences from >2,000 patients with different types of cancers: breast cancer, colon cancer and cutaneous and ocular melanomas matched to more than 7,000 non-cancer controls and analyzed germline variation in known cancer predisposing genes to identify common properties of disease associated mutations and new candidate cancer susceptibility genes. Lists of all cancer predisposing genes were divided into subclasses according to the mode of inheritance of the related cancer syndrome or contribution to known major cancer pathways. Out of all subclasses only genes linked to dominant syndromes presented significant rare germline variants enrichment in cases. Separate analysis of protein-truncating and missense variation in this subclass of genes confirmed significant prevalence of protein-truncating variants in cases only in loss-of-function tolerant genes (pLI<0.1), while ultra-rare missense mutations were significantly overrepresented in cases only in constrained genes (pLI>0.9). Taken together, our findings provide insights into the distribution and types of mutations underlying inherited cancer predisposition.

The extent to which the geographic diversity of the U.S. plays a significant role in melanoma incidence and mortality over time has not been precisely characterized. We obtained age-adjusted melanoma data for the 50 states between the years 2001-2019 from the SEER registry and performed hierarchical clustering (complete linkage, Euclidean space) to uncover geotemporal trend groups over 2 decades. While there was a global increase in incidence during this time (b