Naturally occurring regulatory T cells (nTreg) are crucial for maintaining tolerance to self and thus preventing autoimmune diseases and allograft rejections. In cancer, Treg down-regulate antitumor responses by several distinct mechanisms. This study analyzes the role the adenosinergic pathway plays in suppressive activities of human nTreg. Human CD4(+)CD25(high)FOXP3(+) Treg overexpress CD39 and CD73, ectonucleotidases sequentially converting ATP into AMP and adenosine, which then binds to A(2a) receptors on effector T cells, suppressing their functions. CD4(+)CD39(+) and CD4(+)CD25(high) T cells express low levels of adenosine deaminase (ADA), the enzyme responsible for adenosine breakdown, and of CD26, a surface-bound glycoprotein associated with ADA. In contrast, T effector cells are enriched in CD26/ADA but express low levels of CD39 and CD73. Inhibitors of ectonucleotidase activity (e.g. ARL67156) and antagonists of the A(2a) receptor (e.g. ZM241385) blocked Treg-mediated immunosuppression. The inhibition of ADA activity on effector T cells enhanced Treg-mediated immunosuppression. Thus, human nTreg characterized by the presence of CD39 and the low expression of CD26/ADA are responsible for the generation of adenosine, which plays a major role in Treg-mediated immunosuppression. The data suggest that the adenosinergic pathway represents a potential therapeutic target for regulation of immunosuppression in a broad variety of human diseases.

ABSTRACT In tumor-bearing mice, immunosuppressive granulocytic and monocytic MDSC have been identified. The identity and function of MDSC in cancer patients are less clear and need further characterization. We analyzed the peripheral blood of 103 patients with HNC, lung cancer, or cancers of bladder and ureter. Based on sedimentation properties in density gradients, a subset of LD-PMN was identified and analyzed. LD-PMN were expanded in the peripheral blood of cancer patients, suppressed proliferation, and IFN-γ production of polyclonally stimulated T cells and thus, qualify as human MDSC. Immunophenotyping and morphological analysis revealed the accumulation of immature PMN in the MDSC fraction. Neutrophilic MDSC showed altered surface marker expression, prolonged survival, and impaired effector functions when compared with conventional, mature PMN of regular density. MDSC displayed markedly reduced chemotaxis toward tumor-conditioned medium and lacked expression of chemokine receptors CXCR1 and CXCR2, which are normally required for PMN extravasation from the bloodstream and subsequent tissue infiltration. Collectively, our data suggest the accumulation and persistence of long-lived, immature granulocytic MDSC with T cell-suppressive function and impaired migratory properties in the peripheral blood of cancer patients.

Abstract Purpose: Head and neck cancers (HNCs) often induce profound immunosuppression, which contributes to disease progression and interferes with immune-based therapies. Body fluids of patients with HNC are enriched in exosomes potentially engaged in negative regulation of antitumor immune responses. The presence and content of exosomes derived from plasma of patients with HNC are evaluated for the ability to induce immune dysfunction and influence disease activity. Experimental Design: Exosomes were isolated by size-exclusion chromatography from plasma of 38 patients with HNC and 14 healthy donors. Morphology, size, numbers, and protein and molecular contents of the recovered exosomes were determined. Coculture assays were performed to measure exosome-mediated effects on functions of normal human lymphocyte subsets and natural killer (NK) cells. The results were correlated with disease stage and activity. Results: The presence, quantity, and molecular content of isolated, plasma-derived exosomes discriminated patients with HNC with active disease (AD) from those with no evident disease (NED) after oncologic therapies. Exosomes of patients with AD were significantly more effective than exosomes of patients with NED in inducing apoptosis of CD8+ T cells, suppression of CD4+ T-cell proliferation, and upregulation of regulatory T-cell (Treg) suppressor functions (all at P < 0.05). Exosomes of patients with AD also downregulated NKG2D expression levels in NK cells. Conclusions: Exosomes in plasma of patients with HNC carry immunosuppressive molecules and interfere with functions of immune cells. Exosome-induced immune suppression correlates with disease activity in HNC, suggesting that plasma exosomes could be useful as biomarkers of HNC progression. Clin Cancer Res; 23(16); 4843–54. ©2017 AACR.

The progression of epithelial cancer is associated with an intense immunological interaction between the tumor cells and immune cells of the host. However, little is known about the interaction between tumor cells and polymorphonuclear granulocytes (PMNs) in patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). In our study, we investigated systemic PMN-related alterations in HNSCC, the role of tumor-infiltrating PMNs and their modulation by the tumor microenvironment. We assessed the infiltration of HNSCC tissue by PMNs (retrospectively) and systemic PMN-related alterations in blood values (prospectively) in HNSCC patients (n = 99 and 114, respectively) and control subjects (n = 41). PMN recruitment, apoptosis and inflammatory activity were investigated in an in vitro system of peripheral blood PMNs and a human HNSCC cell line (FaDu). HNSCC tissue exhibited considerable infiltration by PMNs, and strong infiltration was associated with poorer survival in advanced disease. PMN count, neutrophil-to-lymphocyte ratio and serum concentrations of CXCL8 (interleukin-8), CCL4 (MIP-1β) and CCL5 (RANTES) were significantly higher in the peripheral blood of HNSCC patients than in that of controls. In vitro, HNSCC-conditioned medium inhibited apoptosis of PMNs, increased chemokinesis and chemotaxis of PMNs, induced release of lactoferrin and matrix metalloproteinase 9 by PMNs and enhanced the secretion of CCL4 by PMN. Our findings demonstrate alterations in PMN biology in HNSCC patients. In vitro, tumor-derived factors modulate cellular functions of PMNs and increase their inflammatory activity. Thus, the interaction between HNSCC and PMNs may contribute to host-mediated changes in the tumor microenvironment.

Summary While murine CD4+CD39+ regulatory T cells (Treg) co-express CD73 and hydrolyze exogenous (e) adenosine triphosphate (ATP) to immunosuppressive adenosine (ADO), surface co-expression of CD73 on human circulating CD4+CD39+Treg is rare. Therefore, the ability of human Treg to produce and utilize ADO for suppression remains unclear. Using mass spectrometry, we measured nucleoside production by subsets of human CD4+CD39+ and CD4+CD39(–)CD73+T cells or CD19+B cells isolated from blood of 30 volunteers and 14 cancer patients. CD39 and CD73 expression was evaluated by flow cytometry, Western blots, confocal microscopy or reverse transcription–polymerase chain reaction (RT–PCR). Circulating CD4+CD39+Treg which hydrolyzed eATP to 5′-AMP contained few intracytoplasmic granules and had low CD73 mRNA levels. Only ∼1% of these Treg were CD39+CD73+. In contrast, CD4+CD39negCD73+T cells contained numerous CD73+ granules in the cytoplasm and strongly expressed surface CD73. In vitro-generated Treg (Tr1) and most B cells were CD39+CD73+. All these CD73+T cell subsets and B cells hydrolyzed 5′-AMP to ADO. Exosomes isolated from plasma of normal control (NC) or cancer patients carried enzymatically active CD39 and CD73+ and, when supplied with eATP, hydrolyzed it to ADO. Only CD4+CD39+Treg co-incubated with CD4+CD73+T cells, B cells or CD39+CD73+ exosomes produced ADO. Thus, contact with membrane-tethered CD73 was sufficient for ADO production by CD4+CD39+Treg. In microenvironments containing CD4+CD73+T cells, B cells or CD39+CD73+ exosomes, CD73 is readily available to CD4+CD39+CD73negTreg for the production of immunosuppressive ADO.

Improved understanding of expression of immune checkpoint receptors (ICR) on tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) may facilitate more effective immunotherapy in head and neck cancer (HNC) patients. A higher frequency of PD-1+ TIL has been reported in human papillomavirus (HPV)+ HNC patients, despite the role of PD-1 in T-cell exhaustion. This discordance led us to hypothesize that the extent of PD-1 expression more accurately defines T-cell function and prognostic impact, because PD-1high T cells may be more exhausted than PD-1low T cells and may influence clinical outcome and response to anti-PD-1 immunotherapy. In this study, PD-1 expression was indeed upregulated on HNC patient TIL, and the frequency of these PD-1+ TIL was higher in HPV+ patients (P = 0.006), who nonetheless experienced significantly better clinical outcome. However, PD-1high CD8+ TILs were more frequent in HPV- patients and represented a more dysfunctional subset with compromised IFN-γ secretion. Moreover, HNC patients with higher frequencies of PD-1high CD8+ TIL showed significantly worse disease-free survival and higher hazard ratio for recurrence (P < 0.001), while higher fractions of PD-1low T cells associated with HPV positivity and better outcome. In a murine HPV+ HNC model, anti-PD-1 mAb therapy differentially modulated PD-1high/low populations, and tumor rejection associated with loss of dysfunctional PD-1high CD8+ T cells and a significant increase in PD-1low TIL. Thus, the extent of PD-1 expression on CD8+ TIL provides a potential biomarker for anti-PD-1-based immunotherapy. Cancer Res; 77(22); 6353-64. ©2017 AACR.

Tumor-draining lymph nodes (LNs) play a crucial role during cancer spread and in initiation of anti-cancer adaptive immunity. Neutrophils form a substantial population of cells in LNs with poorly understood functions. Here, we demonstrate that, during head and neck cancer (HNC) progression, tumor-associated neutrophils transmigrate to LNs and shape anti-tumor responses in a stage-dependent manner. In metastasis-free stages (N0), neutrophils develop an antigen-presenting phenotype (HLA-DR+CD80+CD86+ICAM1+PD-L1-) and stimulate T cells (CD27+Ki67highPD-1-). LN metastases release GM-CSF and via STAT3 trigger development of PD-L1+ immunosuppressive neutrophils, which repress T cell responses. The accumulation of neutrophils in T cell-rich zones of LNs in N0 constitutes a positive predictor for 5-year survival, while increased numbers of neutrophils in LNs of N1-3 stages predict poor prognosis in HNC. These results suggest a dual role of neutrophils as essential regulators of anti-cancer immunity in LNs and argue for approaches fostering immunostimulatory activity of these cells during cancer therapy.

Zusammenfassung Hintergrund Die Indikation zur elektiven Neck Dissection (END) bei Patienten mit T1/2-Plattenepithelkarzinomen des Hypopharynx (HPSCC) und Oropharynx (OPSCC) wird nicht einheitlich gestellt. In der vorliegenden Studie erfolgte daher eine detaillierte Analyse des Metastasierungsverhaltens von HPSCC und OPSCC. Material und Methoden Es erfolgte eine multizentrische retrospektive Analyse des nodalen Metastasierungsverhaltens und der onkologischen Parameter von 262 chirurgisch therapierten HPSCC- und OPSCC-Patienten. Zudem erfolgte eine systematische Literaturrecherche. Ergebnisse Bei HPSCC-Patienten lag in 62,1% der Fälle eine Diskrepanz zwischen klinischem und pathologischem N-Status vor, bei OPSCC in 52,4% (p16-) bzw. 43,6% (p16+). Die okkulte Metastasierungsrate in den Primärtumorstadien T1/2 lag dabei bei 38,9% für HPSCC und bei 17,8% (p16-) und 11,1% (p16+) für OPSCC. Bei HPSCC traten in den Stadien cT1/2cN0 in 22,2% der Fälle kontralaterale Metastasen auf; die Rate bei OPSCC lag bei lediglich 9,1% (p16-) bzw. 0% (p16+). Patienten mit p16-positiven OPSCC wiesen ein besseres rezidivfreies und Gesamtüberleben auf als p16-negative OPSCC- und HPSCC-Patienten. Ein direkter Zusammenhang zwischen Patientenüberleben und Ausmaß der chirurgischen Therapie des Halses ließ sich nicht nachweisen. Schlussfolgerung Patienten mit HPSCC weisen ab Stadium cT1/2cN0 ein hohes Risiko für okkulte Halslymphknotenmetastasen auf, welches die Durchführung einer beidseitigen END rechtfertigt. Bei Patienten mit T1/2cN0-OPSCC manifestieren sich ipsilateral in >20% der Fälle okkulte Metastasen; das Risiko für eine kontralaterale okkulte Metastasierung liegt jedoch bei <10%, sodass bei streng lateralisierten Tumoren ein Verzicht auf die kontralaterale Neck Dissection erwogen werden kann.

The incidence of cervical squamous cell carcinoma (SCC)-CUP is increasing, with a significant proportion being HPV-associated. In this 10-year retrospective study, we analyzed clinical and therapeutic parameters of patients with cervical SCC-CUP. Primary tumor detection rates in patients with initial SCC-CUP (SCC-CUP