A sensitive approach based on electrospray ionization tandem mass spectrometry has been employed to profile membrane lipid molecular species in Arabidopsis undergoing cold and freezing stresses. Freezing at a sublethal temperature induced a decline in many molecular species of phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), and phosphatidylglycerol (PG) but induced an increase in phosphatidic acid (PA) and lysophospholipids. To probe the metabolic steps generating these changes, lipids ofArabidopsis deficient in the most abundant phospholipase D, PLDα, were analyzed. The PC content dropped only half as much, and PA levels rose only half as high in the PLDα-deficient plants as in wild-type plants. In contrast, neither PE nor PG levels decreased significantly more in wild-type plants than in PLDα-deficient plants. These data suggest that PC, rather than PE and PG, is the majorin vivo substrate of PLDα. The action of PLDα during freezing is of special interest because Arabidopsis plants that are deficient in PLDα have improved tolerance to freezing. The greater loss of PC and increase in PA in wild-type plants as compared with PLDα-deficient plants may be responsible for destabilizing membrane bilayer structure, resulting in a greater propensity toward membrane fusion and cell death in wild-type plants. A sensitive approach based on electrospray ionization tandem mass spectrometry has been employed to profile membrane lipid molecular species in Arabidopsis undergoing cold and freezing stresses. Freezing at a sublethal temperature induced a decline in many molecular species of phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), and phosphatidylglycerol (PG) but induced an increase in phosphatidic acid (PA) and lysophospholipids. To probe the metabolic steps generating these changes, lipids ofArabidopsis deficient in the most abundant phospholipase D, PLDα, were analyzed. The PC content dropped only half as much, and PA levels rose only half as high in the PLDα-deficient plants as in wild-type plants. In contrast, neither PE nor PG levels decreased significantly more in wild-type plants than in PLDα-deficient plants. These data suggest that PC, rather than PE and PG, is the majorin vivo substrate of PLDα. The action of PLDα during freezing is of special interest because Arabidopsis plants that are deficient in PLDα have improved tolerance to freezing. The greater loss of PC and increase in PA in wild-type plants as compared with PLDα-deficient plants may be responsible for destabilizing membrane bilayer structure, resulting in a greater propensity toward membrane fusion and cell death in wild-type plants. electrospray ionization tandem mass spectrometry digalactosyldiacylglycerol monogalactosyldiacylglycerol phosphatidic acid phosphatidylcholine phosphatidylethanolamine phosphatidylglycerol phosphatidylinositol phosphatidylserine phospholipase D Eukaryotic membranes contain diverse lipid molecular species, and the lipid composition changes in response to both internal and external cues. Knowing how lipid molecular species change and how the changes are generated is important to the understanding of membrane and cell functions. Detailed study of membrane lipid changes, however, has been technically challenging because of the complexity of lipid molecular species and analytical procedures. Recently, an approach based on electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS)1 has been developed to comprehensively analyze lipid composition in animal and yeast cells (1Han X. Gubitosi-Klug R.A. Collins B.J. Gross R.W. Biochemistry. 1996; 35: 5822-5832Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar, 2Brügger B. Erben G. Sandhoff R. Wieland F.T. Lehmann W.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 2339-2344Crossref PubMed Scopus (747) Google Scholar, 3Fridriksson E.K. Shipkova P.A. Sheets E.D. Holowka D. Baird B. McLafferty F.W. Biochemistry. 1999; 38: 8056-8063Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar, 4Ramanadham S. Hsu F.F. Bohrer A., Ma, Z. Turk J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 13915-13927Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (103) Google Scholar, 5Brügger B. Sandhoff R. Wegehingel S. Gorgas K. Malsam J. Helms J.B. Lehmann W.D. Nickel W. Wieland F.T. J. Cell Biol. 2000; 151: 507-518Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar, 6Hsu F.-F., Ma, Z. Wohltmann M. Bohrer A. Nowatzke W. Ramanadham S. Turk J. J. Biol. Chem. 2000; 275: 16579-16589Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (48) Google Scholar, 7Ramanadham S. Hsu F. Zhang Bohrer A. Ma Z. Turk J. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1484: 251-266Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar, 8Williams S.D. Hsu F.-F. Ford D.A. J. Lipid Res. 2000; 41: 1585-1595Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 9Blom T.S. Koivusalo M Kuismanen E. Kostiainen R. Somerharju P. Ikonen E. Biochemistry. 2001; 40: 14635-14644Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). It requires only simple sample preparation and small samples to identify and quantify lipid molecular species. Expansion of this approach to plants, which harbor unique lipids, such as galactosylglycerolipids, should greatly facilitate the understanding of lipid functions in plant growth, development, and stress responses. Plant stress caused by freezing has been an area of intensive research for many years, but the molecular and cellular mechanisms of freezing injury and tolerance are not well understood (10Thomashow M.F. Plant Physiol. 1998; 118: 1-7Crossref PubMed Scopus (558) Google Scholar, 11Thomashow M.F. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999; 50: 571-599Crossref PubMed Scopus (2806) Google Scholar, 12Browse J. Xin Z. Curr. Opin. Plant Biol. 2001; 4: 241-246Crossref PubMed Scopus (197) Google Scholar). The best documented freezing injury occurs at the membrane level. One major form of freezing damage is due to the formation of lipid hexagonal II phase in regions where the plasma membrane and the chloroplast envelope are closely apposed (13Steponkus P.L. Annu. Rev. Plant Physiol. 1984; 35: 543-584Crossref Google Scholar, 14Steponkus P.L. Webb M.S. Somero G. Osmond B. Water and Life: Comparative Analysis of Water Relationships at the Organismic, Cellular and Molecular Level. Springer-Verlag Inc., New York1992: 338-362Crossref Google Scholar). Changes in membrane lipid composition occur when plants are exposed to freezing temperatures (15Yoshida S. Sakai A. Plant Physiol. 1974; 53: 509-511Crossref PubMed Google Scholar). Lipid hydrolysis has been proposed to be mainly responsible for the change, but the role of lipid hydrolysis in freezing injury and tolerance is not clear. In plants, several lipolytic enzymatic activities have been described, including phospholipase D (PLD), phospholipase C, phospholipase A, nonspecific acyl hydrolase, and galactolipases. PLD, which hydrolyzes phospholipids to phosphatidic acid (PA) and free head groups, is particularly abundant. Arabidopsis has multiple PLD genes that are categorized as PLDα, β, γ, δ, and ζ. PLDs display different requirements for Ca2+, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, pH, and free fatty acids and also some difference in substrate selectivity (16Pappan K. Zheng S. Wang X. J. Biol. Chem. 1997; 272: 7048-7054Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar, 17Pappan K. Austin-Brown S. Chapman K.D. Wang X. Arch. Biochem. Biophys. 1998; 353: 131-140Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar, 18Qin C. Wang X. Plant Physiol. 2002; 128: 1057-1068Crossref PubMed Scopus (239) Google Scholar). Thus, individual PLDs in the cell may be activated differently, hydrolyze different lipid species, and have unique functions. PLDα, the most common plant PLD, has been abrogated genetically inArabidopsis by introducing a PLDα antisense gene (16Pappan K. Zheng S. Wang X. J. Biol. Chem. 1997; 272: 7048-7054Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar, 19Fan L. Zheng S. Wang X. Plant Cell. 1997; 9: 2183-2196PubMed Google Scholar). The combination of lipid profiling and specific genetic alterations promises to be a powerful approach to defining the in vivoactivity and cellular roles of specific hydrolytic enzymes. In this study, an automated ESI-MS/MS strategy is established to profile quantitatively the molecular species of plant lipids and to determine the lipid changes in Arabidopsis after cold acclimation and freezing at sublethal temperature. Comparative lipid profiling of wild-type and PLDα-deficient plants leads to definition of the in vivo substrate(s) and the contribution of the most abundant PLD isoform to the freezing-induced lipid changes. PLDα-abrogated Arabidopsis displays an enhanced tolerance to freezing. Understanding the in vivo action of PLDα in freezing allows us to suggest a mechanism for the improved freezing tolerance of PLDα-deficient plants. Arabidopsiswild-type (Columbia ecotype) and PLDα-deficient plants (19Fan L. Zheng S. Wang X. Plant Cell. 1997; 9: 2183-2196PubMed Google Scholar) were sown in Scotts Metromix soil. The PLDα-deficiency was confirmed by assaying the PLDα activity and immunoblotting with a PLDα-specific antibody, following the procedure described previously (16Pappan K. Zheng S. Wang X. J. Biol. Chem. 1997; 272: 7048-7054Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar). The pots were kept at 4 °C for 2 days and then moved to a growth chamber at 23 °C (day) and 19 °C (night) with a 12-h day length, daytime fluorescent lighting at 120 μmol m−2 s−1, and 58% relative humidity. For cold acclimation, 35-day-old, preflowering plants were placed at 4 °C for 3 days in a growth chamber with a light intensity of 30 μmol m−2 s−1. Nonacclimated plants remained in the 23 °C growth chamber until they were harvested on the same day that the cold-acclimated plants were harvested. For freezing, cold-acclimated plants at 4 °C were subjected to a temperature drop from 4 to −2 °C at 3 °C/hour in the growth chamber. When the temperature reached −2 °C, ice crystals were placed on the soil to induce crystallization and prevent supercooling. After 2 h at −2 °C, the temperature was lowered to −8 °C at 1 °C/hour. After 2 h at −8 °C, the plants were harvested for lipid analysis. For each sample, the above-ground rosettes of two or three plants were cut at the sampling time and transferred to 3 ml of isopropanol with 0.01% butylated hydroxytoluene at 75 °C. After 15 min, 1.5 ml of chloroform and 0.6 ml of water were added. The tubes were shaken for 1 h, followed by removal of the extract. The plants were re-extracted with chloroform/methanol (2:1) with 0.01% butylated hydroxytoluene five times with 30 min of agitation each time, until all of the remaining plant tissue appeared white. The remaining plant tissue was heated overnight at 105 °C and weighed. The weights of these dried, extracted tissues are the “dry weights” of the plants. The dry weights ranged from 9 to 47 mg. The combined extracts were washed once with 1 ml of 1 m KCl and once with 2 ml of water. The solvent was evaporated under nitrogen, and the lipid extract was dissolved in 1 ml of chloroform. Phospholipid standards were purchased from Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL), except for di24:1-PE and di24:1-PG, which were prepared by transphosphatidylation of di24:1-PC (20Comfurius P. Zwaal R.F.A. Biochim. Biophys. Acta. 1977; 488: 36-42Crossref PubMed Scopus (514) Google Scholar). Phospholipids were quantified by phosphate assay (21Ames B.N. Methods Enzymol. 1966; 8: 115-118Crossref Scopus (3140) Google Scholar), except for the hydrogenated PI components, which were quantified, using pentadecanoic acid as an internal standard, as fatty acid methyl esters, after derivatization in 1.5 m methanolic HCl, by gas-liquid chromatography on a Supelco 30-meter Omegawax 250 capillary column (Sigma-Aldrich). The hydrogenated galactolipid standards were purchased from Matreya, Inc. (State College, PA) and also quantified as fatty acid methyl esters by gas-liquid chromatography. From 1 ml of plant lipid extract, two aliquots were taken for mass spectrometry analysis: one sample for phospholipid analysis and one for galactolipid analysis. For phospholipid analysis, 150 μl of plant lipid extract in chloroform was combined with solvents and internal standards, such that the ratio of chloroform/methanol/ammonium acetate (300 mm) in water was 300:665:35, the final volume was 1.8 ml, and the sample contained 6.6 nmol of di14:0-PC, 6.6 nmol of di24:1-PC, 6.6 nmol of 13:0-lysoPC, 6.6 nmol of 19:0-lysoPC, 3.6 nmol of di14:0-PE, 3.6 nmol of di24:1-PE, 3.6 nmol of 14:0-lysoPE, 3.6 nmol of 18:0-lysoPE, 3.6 nmol of di14:0-PG, 3.6 nmol of di24:1-PG, 3.6 nmol of 14:0-lysoPG, 3.6 nmol of 18:0-lysoPG, 3.6 nmol of di14:0-PA, 3.6 nmol of di20:0(phytanoyl)-PA, 2.4 nmol of di14:0-PS, 2.4 nmol of di20:0(phytanoyl)-PS, 1.97 nmol of 16:0–18:0-PI, and 1.63 nmol of di18:0-PI. For galactolipid analysis, 80 μl of plant lipid extract in chloroform was combined with solvent and internal standards, such that the ratio of chloroform/methanol/sodium acetate (50 mm) in water was 300:665:35, the final volume was 0.8 ml, and the sample contained 44.55 nmol of 16:0–18:0-MGDG, 35.45 nmol of di18:0-MGDG, 8.65 nmol of 16:0–18:0-DGDG, and 31.28 nmol of di18:0-DGDG. The samples were analyzed on a “triple” quadrupole tandem mass spectrometer (Micromass Ultima, Micromass Ltd., Manchester, UK) equipped for electrospray ionization. The source temperature was 100 °C, the desolvation temperature was 250 °C, ±2.8 kV was applied to the electrospray capillary, the cone energy was 40 V, and argon was used as the collision gas at 1.7 e−3 mBar as measured on the gauge in the collision cell line. The samples were introduced using an autosampler (LC Mini PAL, CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland) fitted with the required injection loop for the acquisition time and presented to the electrospray ionization needle at 30 μl/min. Precursors of lipid head group-derived fragments were detected using the scans listed in Table I. The mass analyzers were adjusted to a resolution of 0.6 atomic mass unit full width at half height. For each spectrum, 12–42 continuum scans were averaged in multiple channel analyzer mode. The phospholipid scanning modes were described by Brügger et al. (2Brügger B. Erben G. Sandhoff R. Wieland F.T. Lehmann W.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 2339-2344Crossref PubMed Scopus (747) Google Scholar). The galactolipid product ions were reported by Kim et al. (22Kim Y.H. Choi J.-S. Yoo J.S. Park Y.-M. Kim M.S. Anal. Biochem. 1999; 267: 260-270Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar).Table IMass spectrometry analysis parametersLipid(s) analyzedIon analyzedScan modePolarityCollision energyTimeVminPC[M+H]+Precursors of m/z184++282LysoPC[M+H]+Precursors ofm/z 184++252PE/LysoPE[M+H]+Neutral loss of 141 amu+202PA/PG/LysoPG[M−H]−Precursors ofm/z 153−−407PI[M−H]−Precursors of m/z241−−433PS1-aNeutral loss of 87 scanning in the negative mode for PS demonstrated that Arabidopsiscontains about 0.4 nmol of PS/mg dry weight and that 34:2 and 34:3 are the major PS species, but the sensitivity of this scan mode did not allow detailed analysis.[M−H]−Neutral loss of 87 amu−257MGDG[M+Na]+Precursors ofm/z 243++455DGDG[M+Na]+Precursors ofm/z 243++6651-a Neutral loss of 87 scanning in the negative mode for PS demonstrated that Arabidopsiscontains about 0.4 nmol of PS/mg dry weight and that 34:2 and 34:3 are the major PS species, but the sensitivity of this scan mode did not allow detailed analysis. Open table in a new tab Data processing was performed using Masslynx software (Micromass Ltd.). Each head group-specific scan was collected as one continuum spectrum. In each spectrum, the background was subtracted, the data were smoothed, and then peak height was determined with the centroiding routine. Identification of the peaks of interest and calculation of lipid species amounts were performed using Microsoft Excel. Corrections for overlap of isotopic variants (A + 2 peaks) in higher mass lipids were applied. The lipids in each class were quantified in comparison with the two internal standards of that class using a correction curve determined between standards. The molar response of homologs within a head group is mass-dependent and largely dictated by collision energy. However, no collision energy was found that allowed spectral abundances to equal molar ratios. The shape of the mass-dependent correction curve between the internal standards was established for PC, PE, PG, PA, and lysoPC using standards of intermediate mass as described by Brügger et al. (2Brügger B. Erben G. Sandhoff R. Wieland F.T. Lehmann W.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 2339-2344Crossref PubMed Scopus (747) Google Scholar). The data were fit with a second order polynomial. The standard curves were slightly upward for PC and PE and downward for PA, PG, and lysoPC. A straight line was used to interpolate and extrapolate the two internal standard values to the masses of the plant sample components in lysoPE, PI, MGDG, and DGDG spectra. The lipids chosen as internal standards were not present in measurable quantities in representative plant lipid samples. However, because there was a possibility that lysoPEs that were identical to the internal standards might occur in low quantities in some samples, large amounts of the internal standards relative to the amount of plant lysoPE were used, so that any endogenous 14:0- or 18:0-lysoPE would be irrelevant in the calculation of the amount of the other lysoPE species. Five replicates of each treatment for each phenotype were carried out and analyzed by mass spectrometry. The Q test for discordant data (23Shoemaker D.P. Garland C.W. Steinfeld D.P. Experiments in Physical Chemistry. McGraw-Hill Inc., New York1974: 34-39Google Scholar) was performed on the replicates of the total amount of lipid in each head group class. If one head group total value met the criteria for discordance, the data from that replicate sample for that head group class were discarded. Thus, the values from either four or five replicates were averaged, and the standard deviations were calculated. Paired values were subjected to t tests to determine statistical significance. The acyl groups of the major phospholipid species in a lipid extract from wild-type plants were identified as acyl anions from the appropriate negative ion precursors. The collision energies were 20–55 V. The solvent was chloroform/methanol/ammonium acetate (300 mm) in water (300:665:35). PG, PI, PE, lysoPE, and PA were analyzed as [M − H]− ions, MGDG and DGDG were analyzed as [M − H]− and [M + acetate]− ions, and PC and lysoPC were analyzed as [M + acetate]− ions. The relative abundance of the fatty acyl ions was used to designate the position of the acyl chain, because the acyl group in the 2-position generally produces the more abundant ion (24Murphy R.C. Mass Spectrometry of Lipids: Handbook of Lipid Research. 7. Plenum Press, New York1993: 223-226Google Scholar). Total protein from Arabidopsis leaves was extracted by grinding in an ice-chilled mortar and pestle with buffer A as described previously (19Fan L. Zheng S. Wang X. Plant Cell. 1997; 9: 2183-2196PubMed Google Scholar). Equal amounts of protein were separated by an 8% gel and transferred onto polyvinylidene difluoride filters. The membranes were blotted with a PLDα-specific antibody, followed by incubation with a second antibody conjugated to alkaline phosphatase, as described previously (19Fan L. Zheng S. Wang X. Plant Cell. 1997; 9: 2183-2196PubMed Google Scholar). PLDα activity was determined using egg yolk (PC) mixed with dipalmitoylglycerol-3-phospho[methyl-3H]choline as described previously (19Fan L. Zheng S. Wang X. Plant Cell. 1997; 9: 2183-2196PubMed Google Scholar). Total RNA was isolated fromArabidopsis rosettes. Equal amounts of total RNA (10 μg/lane) were separated by 1% formaldehyde-agarose denaturing gel electrophoresis and transferred to nylon membranes. The full-length PLDα-cDNA was labeled with [α-32P]dCTP by random priming. The isolation and hybridization were performed as described previously (25Wang C. Wang X. Plant Physiol. 2001; 127: 1102-1112Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar). To measure ionic leakage, Arabidopsis rosettes were collected 1 h after freezing at indicated temperatures and then incubated at 4 °C for 24 h. Deionized water was added, and conductivity of the solution was measured after gentle agitation at 23 °C for 1 h. Total ionic strength was measured after the solution was heated in 100 °C water bath for 10 min and cooled to 23 °C. Leaked ions were calculated as described previously (19Fan L. Zheng S. Wang X. Plant Cell. 1997; 9: 2183-2196PubMed Google Scholar). To test freezing tolerance, wild-type and PLDα-deficient plants were grown aseptically on agar containing Murashige and Skoog basal medium for 4 weeks. The plants were cold acclimated at 2 °C for 24 h, and the temperature was then lowered 1 °C/h to −10 °C. After being at −10 °C for 2 h, the plants were placed at 4 °C for 4 h and then grown at 23 °C. Electrospray ionization of crude lipid extracts ofArabidopsis rosettes results in the generation of singly charged molecular ions with excellent concentration sensitivity. The molecular species of phospholipids PC, PE, PG, PI, PS, PA, lysoPC, and lysoPE were identified by precursor or neutral loss scanning (Table I). To develop the ESI-MS/MS analysis of MGDG and DGDG, which are major plant lipids and unique to photosynthetic membranes, the fragmentation pattern of Arabidopsis galactosylglycerolipids was interpreted based on the analysis of cyanobacterial lipid species using fast atom bombardment tandem mass spectrometry (Ref. 22Kim Y.H. Choi J.-S. Yoo J.S. Park Y.-M. Kim M.S. Anal. Biochem. 1999; 267: 260-270Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar and Table I). The major molecular species of MGDG are 34:6 (16:3–18:3) and 36:6 (di18:3) (Fig. 1 and Table II). This is consistent with the fatty acid composition of MGDG, which is mainly hexadecatrienoic (16:3) and linolenic (18:3) acids (26Miquel M. Cassagne C. Browse J. Plant Physiol. 1998; 117: 923-930Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 27Zien C.A. Wang C. Wang X. Welti R. Biochim. Biophys. Acta. 2001; 1530: 236-248Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). The major molecular species of DGDG are 34:3 (16:0–18:3) and 36:6 (di18:3), which is consistent with the fatty acid composition of DGDG, which is largely palmitic (16:0) and linolenic (18:3) acids (26Miquel M. Cassagne C. Browse J. Plant Physiol. 1998; 117: 923-930Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 27Zien C.A. Wang C. Wang X. Welti R. Biochim. Biophys. Acta. 2001; 1530: 236-248Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar).Table IIMajor acyl species of the most common lipid molecular species in Arabidopsis leavesAcyl chainPCPEPAPIPGMGDGDGDG34:216:0–18:216:0–18:218:2–16:018:2–16:018:2–16:034:316:0–18:3 > 16:1–18:216:0–18:318:3–16:018:3–16:018:3–16:0 > 18:2–16:118:3–16:034:416:1–18:334:616:3–18:316:3–18:316:3–18:336:218:0–18:2 > 18:1–18:118:0–18:218:0–18:236:318:1–18:2 > 18:0–18:318:1–18:2 > 18:0–18:318:0–18:3 ≈ 18:1–18:236:418:2–18:2 > 18:1–18:318:2–18:2 > 18:1–18:318:2–18:2 > 18:1–18:336:518:3–18:218:3–18:218:3–18:236:618:3–18:318:3–18:318:3–18:318:3–18:318:3–18:3 Open table in a new tab The lipids in each class were quantified in comparison with two internal standards of that class. To verify the quantitativeness of the MS/MS data, the amount and fatty acid composition of each head group class (Table III), as determined by ESI-MS/MS, were compared with those determined previously using traditional lipid analyses of Arabidopsis leaves (26Miquel M. Cassagne C. Browse J. Plant Physiol. 1998; 117: 923-930Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 27Zien C.A. Wang C. Wang X. Welti R. Biochim. Biophys. Acta. 2001; 1530: 236-248Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). They are in good agreement. Compared with the traditional analysis, however, the ESI-MS/MS approach requires simple sample preparation, small samples, and short analysis time to identify and quantify lipid molecular species. Profiling of the molecular species of PC, PE, PG, PI, PA, lysoPC, lysoPE, MGDG, and DGDG takes 26 min (Table I). ESI-MS/MS can detect the major and also minor molecular species, such as PA and lysophospholipids (Figs. 1 and2). ESI-MS/MS also allowed detection of minor PE and PC species containing long chain fatty acyl groups (Fig.1). Signals can be easily observed from phospholipid components as dilute as 10 nm. Moreover, this analysis provides information on molecular species, with lipids immediately being speciated to the level of total acyl chain length and the total number of double bonds within a head group class. Fragment analysis in the negative mode allowed identification of fatty acyl groups and tentative assignment of these groups to the sn-1 and sn-2 positions (Table II).Table IIITotal amount of lipid in each head group class in cold acclimation and freezingLipidCold acclimation experimentFreezing experimentIn non-acclimated plantsIn cold-acclimated plantsIn cold-acclimated plantsIn plants subjected to −8 °C treatmentnmol/mgAmount of lipid per dry weight in wild-type plantsPI5.1 ± 0.75.5 ± 0.45.4 ± 0.35.9 ± 0.6PG22.3 ± 1.924.5 ± 1.724.0 ± 1.218.8 ± 2.63-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).PE11.7 ± 1.414.3 ± 2.615.5 ± 0.89.7 ± 1.73-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).PC22.8 ± 0.723.6 ± 2.326.0 ± 0.214.4 ± 1.13-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).PA1.2 ± 0.13-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).1.9 ± 0.51.9 ± 0.311.5 ± 1.03-bThe value is higher than that of cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).MGDG71.4 ± 5.13-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).87.8 ± 6.077.0 ± 2.571.5 ± 8.3DGDG30.7 ± 2.83-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).41.9 ± 3.535.9 ± 0.940.2 ± 4.9LysoPE0.12 ± 0.033-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).0.20 ± 0.010.06 ± 0.020.80 ± 0.113-bThe value is higher than that of cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).LysoPC0.14 ± 0.013-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).0.20 ± 0.020.09 ± 0.030.71 ± 0.143-bThe value is higher than that of cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).Amount of lipid per dry weight in PLDα-deficient plantsPI4.7 ± 0.55.6 ± 0.74.8 ± 0.33-cThe value for the PLDα-deficient plant is different from that of wild-type plants treated in the same way in the same experiment (p < 0.05).5.1 ± 0.43-cThe value for the PLDα-deficient plant is different from that of wild-type plants treated in the same way in the same experiment (p < 0.05).PG20.7 ± 2.923.5 ± 2.624.2 ± 0.820.2 ± 2.03-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).PE10.9 ± 1.23-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).15.0 ± 1.716.5 ± 1.410.1 ± 2.23-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).PC23.1 ± 0.43-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).25.0 ± 0.627.4 ± 0.73-cThe value for the PLDα-deficient plant is different from that of wild-type plants treated in the same way in the same experiment (p < 0.05).21.4 ± 1.63-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).3-cThe value for the PLDα-deficient plant is different from that of wild-type plants treated in the same way in the same experiment (p < 0.05).PA0.8 ± 0.33-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).1.4 ± 0.31.2 ± 0.13-cThe value for the PLDα-deficient plant is different from that of wild-type plants treated in the same way in the same experiment (p < 0.05).5.8 ± 0.23-bThe value is higher than that of cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).3-cThe value for the PLDα-deficient plant is different from that of wild-type plants treated in the same way in the same experiment (p < 0.05).MGDG64.8 ± 7.278.2 ± 12.077.8 ± 0.668.2 ± 4.03-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).DGDG26.2 ± 5.53-aThe value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).39.7 ± 3.536.9 ± 3.139.9 ± 0.4LysoPE0.15 ± 0.050.21 ± 0.010.08 ± 0.010.80 ± 0.243-bThe value is higher than that of cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).LysoPC0.17 ± 0.030.18 ± 0.040.10 ± 0.010.84 ± 0.123-bThe value is higher than that of cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).3-a The value is lower than that of the cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).3-b The value is higher than that of cold-acclimated plants of the same genotype in the same experiment (p < 0.05).3-c The value for the PLDα-deficient plant is different from that of w

ABSTRACT

 Accurate identification of cows' likelihood of conception during the period from recent calving to the first artificial insemination (AI) will provide assistance in managing the fertility of dairy cows and contribute to the economic prosperity and sustainability of the farm. The purpose of this study was to use FTIR spectroscopy collected from recent calving to the first artificial insemination (AI) to predict the cow's likelihood of conception to first AI, first or second AI. This study specifically focused on the role of FTIR spectral and farm data collected at different time windows in improving the accuracy of model for predicting the cow's likelihood of conception to first AI, first or second AI. From 2019 to 2023, fertility information of 10,873 Holstein dairy cows in China were collected, coupled with 21,928 spectral data. First, cows were classified into "good" and "poor." Strategy 1 (S1) defined "good" as cows conceived at first AI and "poor" as the others. Strategy 2 (S2) defined "good" as cows conceived at first or second AI and "poor" as the others. Second, the partial least squares discriminant analysis was used to establish models for predicting the likelihood of conception to first AI, first or second AI. The model was assessed using a cross-validation (CV) set and herd-independent-external validation (HEV) set. The study also focused on examining the potential correlation between the accuracy of prediction and the period of spectral and farm data collection by analyzing the diagnostic performance of the model at 8 different time windows: '0 to 7 d postpartum (dpp)', '8 to 14 dpp', '15 to 21 dpp', '22 to 30 dpp', '31 to 45 dpp', '46 to 60 dpp', ' ≥ 61 dpp', and '0 to 7 d before the first AI'. The results showed that the model based on S1 performed better while in proximity to the first AI with AUC_CV and AUC_HEV of 0.621 and 0.633, respectively. Models based on S2 exhibited superior performance throughout the late phase of uterine involution. The optimal model was developed by using spectral data collected from '22 to 30 dpp'. The AUC_CV and AUC_HEV were 0.644 and 0.660, respectively, which was higher than that of S1. This study demonstrates the potential of using FTIR spectral data to predict the cow's ability to conceive. The model developed from data collected within a certain time window exhibited better prediction accuracy, particularly during 22 to 30 dpp and 0 to 7 d before the first AI. This study offers novel perspectives on alternate approaches for assessing the fertility of cows, which will contribute to the regularization and sustainability of farms, as well as to the precision management of agriculture.