Although single-cell RNA sequencing studies have begun to provide compendia of cell expression profiles1-9, it has been difficult to systematically identify and localize all molecular cell types in individual organs to create a full molecular cell atlas. Here, using droplet- and plate-based single-cell RNA sequencing of approximately 75,000 human cells across all lung tissue compartments and circulating blood, combined with a multi-pronged cell annotation approach, we create an extensive cell atlas of the human lung. We define the gene expression profiles and anatomical locations of 58 cell populations in the human lung, including 41 out of 45 previously known cell types and 14 previously unknown ones. This comprehensive molecular atlas identifies the biochemical functions of lung cells and the transcription factors and markers for making and monitoring them; defines the cell targets of circulating hormones and predicts local signalling interactions and immune cell homing; and identifies cell types that are directly affected by lung disease genes and respiratory viruses. By comparing human and mouse data, we identified 17 molecular cell types that have been gained or lost during lung evolution and others with substantially altered expression profiles, revealing extensive plasticity of cell types and cell-type-specific gene expression during organ evolution including expression switches between cell types. This atlas provides the molecular foundation for investigating how lung cell identities, functions and interactions are achieved in development and tissue engineering and altered in disease and evolution.

Ageing is characterized by a progressive loss of physiological integrity, leading to impaired function and increased vulnerability to death1. Despite rapid advances over recent years, many of the molecular and cellular processes that underlie the progressive loss of healthy physiology are poorly understood2. To gain a better insight into these processes, here we generate a single-cell transcriptomic atlas across the lifespan of Mus musculus that includes data from 23 tissues and organs. We found cell-specific changes occurring across multiple cell types and organs, as well as age-related changes in the cellular composition of different organs. Using single-cell transcriptomic data, we assessed cell-type-specific manifestations of different hallmarks of ageing-such as senescence3, genomic instability4 and changes in the immune system2. This transcriptomic atlas-which we denote Tabula Muris Senis, or 'Mouse Ageing Cell Atlas'-provides molecular information about how the most important hallmarks of ageing are reflected in a broad range of tissues and cell types.

Ageing is the single greatest cause of disease and death worldwide, and understanding the associated processes could vastly improve quality of life. Although major categories of ageing damage have been identified—such as altered intercellular communication, loss of proteostasis and eroded mitochondrial function1—these deleterious processes interact with extraordinary complexity within and between organs, and a comprehensive, whole-organism analysis of ageing dynamics has been lacking. Here we performed bulk RNA sequencing of 17 organs and plasma proteomics at 10 ages across the lifespan of Mus musculus, and integrated these findings with data from the accompanying Tabula Muris Senis2—or ‘Mouse Ageing Cell Atlas’—which follows on from the original Tabula Muris3. We reveal linear and nonlinear shifts in gene expression during ageing, with the associated genes clustered in consistent trajectory groups with coherent biological functions—including extracellular matrix regulation, unfolded protein binding, mitochondrial function, and inflammatory and immune response. Notably, these gene sets show similar expression across tissues, differing only in the amplitude and the age of onset of expression. Widespread activation of immune cells is especially pronounced, and is first detectable in white adipose depots during middle age. Single-cell RNA sequencing confirms the accumulation of T cells and B cells in adipose tissue—including plasma cells that express immunoglobulin J—which also accrue concurrently across diverse organs. Finally, we show how gene expression shifts in distinct tissues are highly correlated with corresponding protein levels in plasma, thus potentially contributing to the ageing of the systemic circulation. Together, these data demonstrate a similar yet asynchronous inter- and intra-organ progression of ageing, providing a foundation from which to track systemic sources of declining health at old age. Bulk RNA sequencing of organs and plasma proteomics at different ages across the mouse lifespan is integrated with data from the Tabula Muris Senis, a transcriptomic atlas of ageing mouse tissues, to describe organ-specific changes in gene expression during ageing.

The ability to slow or reverse biological ageing would have major implications for mitigating disease risk and maintaining vitality1. Although an increasing number of interventions show promise for rejuvenation2, their effectiveness on disparate cell types across the body and the molecular pathways susceptible to rejuvenation remain largely unexplored. Here we performed single-cell RNA sequencing on 20 organs to reveal cell-type-specific responses to young and aged blood in heterochronic parabiosis. Adipose mesenchymal stromal cells, haematopoietic stem cells and hepatocytes are among those cell types that are especially responsive. On the pathway level, young blood invokes new gene sets in addition to reversing established ageing patterns, with the global rescue of genes encoding electron transport chain subunits pinpointing a prominent role of mitochondrial function in parabiosis-mediated rejuvenation. We observed an almost universal loss of gene expression with age that is largely mimicked by parabiosis: aged blood reduces global gene expression, and young blood restores it in select cell types. Together, these data lay the groundwork for a systemic understanding of the interplay between blood-borne factors and cellular integrity.

The Tabula Muris Consortium We have created a compendium of single cell transcriptome data from the model organism Mus musculus comprising more than 100,000 cells from 20 organs and tissues. These data represent a new resource for cell biology, revealing gene expression in poorly characterized cell populations and allowing for direct and controlled comparison of gene expression in cell types shared between tissues, such as T-lymphocytes and endothelial cells from distinct anatomical locations. Two distinct technical approaches were used for most tissues: one approach, microfluidic droplet-based 3’-end counting, enabled the survey of thousands of cells at relatively low coverage, while the other, FACS-based full length transcript analysis, enabled characterization of cell types with high sensitivity and coverage. The cumulative data provide the foundation for an atlas of transcriptomic cell biology.

ABSTRACT Early stages of deadly respiratory diseases such as COVID-19 have been challenging to elucidate due to lack of an experimental system that recapitulates the cellular and structural complexity of the human lung while allowing precise control over disease initiation and systematic interrogation of molecular events at cellular resolution. Here we show healthy human lung slices cultured ex vivo can be productively infected with SARS-CoV-2, and the cellular tropism of the virus and its distinct and dynamic effects on host cell gene expression can be determined by single cell RNA sequencing and reconstruction of “infection pseudotime” for individual lung cell types. This revealed that the prominent SARS-CoV-2 target is a population of activated interstitial macrophages (IMs), which as infection proceeds accumulate thousands of viral RNA molecules per cell, comprising up to 60% of the cellular transcriptome and including canonical and novel subgenomic RNAs. During viral takeover of IMs, there is cell-autonomous induction of a pro-fibrotic program ( TGFB1 , SPP1 ), and an inflammatory program characterized by the early interferon response, chemokines ( CCL2 , 7, 8 , 13, CXCL10 ) and cytokines ( IL6, IL10) , along with destruction of cellular architecture and formation of dense viral genomic RNA bodies revealed by super-resolution microscopy. In contrast, alveolar macrophages (AMs) showed neither viral takeover nor induction of a substantial inflammatory response, although both purified AMs and IMs supported production of infectious virions. Spike-dependent viral entry into AMs was neutralized by blockade of ACE2 or Sialoadhesin/CD169, whereas IM entry was neutralized only by DC-SIGN/CD209 blockade. These results provide a molecular characterization of the initiation of COVID-19 in human lung tissue, identify activated IMs as a prominent site of viral takeover and focus of inflammation and fibrosis, and suggest therapeutic targeting of the DC-SIGN/CD209 entry mechanism to prevent IM infection, destruction and early pathology in COVID-19 pneumonia. Our approach can be generalized to define the initiation program and evaluate therapeutics for any human lung infection at cellular resolution.

ABSTRACT Pulmonary neuroendocrine cells (PNECs) are sensory epithelial cells that transmit airway status to the brain via sensory neurons and locally via CGRP and GABA. Several other neuropeptides and neurotransmitters have been detected in various species, but the number, targets, functions, and conservation of PNEC signals are largely unknown. We used scRNAseq to profile hundreds of the rare mouse and human PNECs. This revealed >40 PNEC neuropeptide and peptide hormone genes, most cells expressing unique combinations of 5-18 genes. Peptides are packaged in separate vesicles, release presumably regulated by the distinct, multimodal combinations of sensors expressed by each PNEC. Expression of cognate receptors predicts an array of local targets, and we show the new PNEC signal angiotensin directly activates innervating sensory neurons. Many signals lack lung targets so may have endocrine activity like those of PNEC- derived carcinoid tumors. PNECs are an extraordinarily rich and diverse signaling hub rivaling the enteroendocrine system.

After introducing IL-1/IL-6 inhibitors, some patients with Still and Still-like disease developed unusual, often fatal, pulmonary disease. This complication was associated with scoring as DReSS (drug reaction with eosinophilia and systemic symptoms) implicating these inhibitors, although DReSS can be difficult to recognize in the setting of systemic inflammatory disease.

Peripheral glia are important regulators of diverse physiologic functions yet their molecular distinctions and locations in almost all visceral organs are not well-understood. We performed a systematic analysis of peripheral glia, focusing on the lung and leveraging single cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis to characterize their cellular and molecular features. Using in vivo lineage studies, we characterized the anatomic, cellular, and molecular features of the Sox10+ glial lineage of the mouse lung. Using high-resolution imaging, we quantified the distribution and cellular morphologies of myelinating, non-myelinating, satellite, and terminal glial cells with their intricate extensions along peripheral nerves, including terminals at specialized neurosensory structures within the lung. Spatial analysis of selectively expressed myelinating (periaxin/Prx, claudin 19/Cldn) or non-myelinating (sodium channel/Scn7a) glial cell genes identified by scRNA-seq analysis revealed molecularly distinct populations surrounding myelinated nerve fibers in the lung. To extend this analysis to primates and other organs, we extracted rare peripheral glial cells in whole organism scRNA-seq atlases of mouse lemur and human. Our cross-species data analysis and integration of scRNA-seq data of ~700 peripheral glial cells from mouse, mouse lemur, and human glial cells identified conserved gene expression of molecularly distinct peripheral glial cell populations. This foundational knowledge facilitates subsequent functional studies targeting molecularly distinct subsets of peripheral glia and integrating them into organ-specific disorders of autonomic dysregulation. In addition, our cross-species analysis identifying conserved gene expression patterns and glial networks in extrapulmonary organs provides a valuable resource for studying the functional role of peripheral glia in multiorgan human diseases.

The COVID-19 pandemic, caused by the novel coronavirus SARS-CoV-2, creates an urgent need for identifying molecular mechanisms that mediate viral entry, propagation, and tissue pathology. Cell membrane bound angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and associated proteases, transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2) and Cathepsin L (CTSL), were previously identified as mediators of SARS-CoV2 cellular entry. Here, we assess the cell type-specific RNA expression of ACE2, TMPRSS2, and CTSL through an integrated analysis of 107 single-cell and single-nucleus RNA-Seq studies, including 22 lung and airways datasets (16 unpublished), and 85 datasets from other diverse organs. Joint expression of ACE2 and the accessory proteases identifies specific subsets of respiratory epithelial cells as putative targets of viral infection in the nasal passages, airways, and alveoli. Cells that co-express ACE2 and proteases are also identified in cells from other organs, some of which have been associated with COVID-19 transmission or pathology, including gut enterocytes, corneal epithelial cells, cardiomyocytes, heart pericytes, olfactory sustentacular cells, and renal epithelial cells. Performing the first meta-analyses of scRNA-seq studies, we analyzed 1,176,683 cells from 282 nasal, airway, and lung parenchyma samples from 164 donors spanning fetal, childhood, adult, and elderly age groups, associate increased levels of ACE2, TMPRSS2, and CTSL in specific cell types with increasing age, male gender, and smoking, all of which are epidemiologically linked to COVID-19 susceptibility and outcomes. Notably, there was a particularly low expression of ACE2 in the few young pediatric samples in the analysis. Further analysis reveals a gene expression program shared by ACE2+TMPRSS2+ cells in nasal, lung and gut tissues, including genes that may mediate viral entry, subtend key immune functions, and mediate epithelial-macrophage cross-talk. Amongst these are IL6, its receptor and co-receptor, IL1R, TNF response pathways, and complement genes. Cell type specificity in the lung and airways and smoking effects were conserved in mice. Our analyses suggest that differences in the cell type-specific expression of mediators of SARS-CoV-2 viral entry may be responsible for aspects of COVID-19 epidemiology and clinical course, and point to putative molecular pathways involved in disease susceptibility and pathogenesis.### Competing Interest StatementN.K. was a consultant to Biogen Idec, Boehringer Ingelheim, Third Rock, Pliant, Samumed, NuMedii, Indaloo, Theravance, LifeMax, Three Lake Partners, Optikira and received non-financial support from MiRagen. All of these outside the work reported. J.L. is a scientific consultant for 10X Genomics Inc A.R. is a co-founder and equity holder of Celsius Therapeutics, an equity holder in Immunitas, and an SAB member of ThermoFisher Scientific, Syros Pharmaceuticals, Asimov, and Neogene Therapeutics O.R.R., is a co-inventor on patent applications filed by the Broad Institute to inventions relating to single cell genomics applications, such as in PCT/US2018/060860 and US Provisional Application No. 62/745,259. A.K.S. compensation for consulting and SAB membership from Honeycomb Biotechnologies, Cellarity, Cogen Therapeutics, Orche Bio, and Dahlia Biosciences. S.A.T. was a consultant at Genentech, Biogen and Roche in the last three years. F.J.T. reports receiving consulting fees from Roche Diagnostics GmbH, and ownership interest in Cellarity Inc. L.V. is funder of Definigen and Bilitech two biotech companies using hPSCs and organoid for disease modelling and cell based therapy.