Key Points Activated NK cells loose CD16 (FcRγIII) and CD62L through a metalloprotease called ADAM17. Inhibition of ADAM17 enhances CD16 mediated NK cell function by preserving CD16 on the NK cell surface to enhance ADCC.

The graft versus leukemia effect by natural killer (NK) cells prevents relapse following hematopoietic stem cell transplantation. We determined whether a novel bispecific killer cell engager (BiKE) signaling through CD16 and targeting CD33 could activate NK cells at high potency against acute myelogenous leukemia (AML) targets.We investigated the ability of our fully humanized CD16 × CD33 (CD16 × 33) BiKE to trigger in vitro NK cell activation against HL60 (CD33(+)), RAJI (CD33(-)), and primary AML targets (de novo and refractory) to determine whether treatment with CD16 × 33 BiKE in combination with an ADAM17 inhibitor could prevent CD16 shedding (a novel inhibitory mechanism induced by NK cell activation) and overcome inhibition of class I MHC recognizing inhibitory receptors.NK cell cytotoxicity and cytokine release were specifically triggered by the CD16 × 33 BiKE when cells were cultured with HL60 targets, CD33(+) de novo and refractory AML targets. Combination treatment with CD16 × 33 BiKE and ADAM17 inhibitor resulted in inhibition of CD16 shedding in NK cells, and enhanced NK cell activation. Treatment of NK cells from double umbilical cord blood transplant (UCBT) recipients with the CD16 × 33 BiKE resulted in activation, especially in those recipients with cytomegalovirus reactivation.CD16 × 33 BiKE can overcome self-inhibitory signals and effectively elicit NK cell effector activity against AML. These in vitro studies highlight the potential of CD16 × 33 BiKE ± ADAM17 inhibition to enhance NK cell activation and specificity against CD33(+) AML, which optimally could be applied in patients with relapsed AML or for adjuvant antileukemic therapy posttransplantation.

Abstract Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is a key effector mechanism of natural killer (NK) cells that is mediated by therapeutic monoclonal antibodies (mAbs). This process is facilitated by the Fc receptor CD16a on human NK cells. CD16a appears to be the only activating receptor on NK cells that is cleaved by the metalloprotease a disintegrin and metalloproteinase-17 upon stimulation. We previously demonstrated that a point mutation of CD16a prevents this activation-induced surface cleavage. This noncleavable CD16a variant is now further modified to include the high-affinity noncleavable variant of CD16a (hnCD16) and was engineered into human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to create a renewable source for human induced pluripotent stem cell–derived NK (hnCD16-iNK) cells. Compared with unmodified iNK cells and peripheral blood–derived NK (PB-NK) cells, hnCD16-iNK cells proved to be highly resistant to activation-induced cleavage of CD16a. We found that hnCD16-iNK cells were functionally mature and exhibited enhanced ADCC against multiple tumor targets. In vivo xenograft studies using a human B-cell lymphoma demonstrated that treatment with hnCD16-iNK cells and anti-CD20 mAb led to significantly improved regression of B-cell lymphoma compared with treatment utilizing anti-CD20 mAb with PB-NK cells or unmodified iNK cells. hnCD16-iNK cells, combined with anti-HER2 mAb, also mediated improved survival in an ovarian cancer xenograft model. Together, these findings show that hnCD16-iNK cells combined with mAbs are highly effective against hematologic malignancies and solid tumors that are typically resistant to NK cell–mediated killing, demonstrating the feasibility of producing a standardized off-the-shelf engineered NK cell therapy with improved ADCC properties to treat malignancies that are otherwise refractory.

Tumors can evade natural killer (NK) cells is by activating inhibitory pathways. We therefore have developed a highly efficient CRISPR/Cas9-based method for editing the genome of peripheral blood human NK cells (PB-NKs) to knock out ADAM17 and PD1 or knock-in genes using recombinant AAV6. Our method allows editing of PB-NKs at efficiencies reaching 90%, equivalent to methods reported for primary human T cells. Moreover, we demonstrate that ADAM17 and PD1 KO PB-NKs have significantly improved activity, cytokine production, and cancer cell cytotoxicity. Our platform represents a feasible method for generating engineered NK cells as a universal therapeutic for cancer immunotherapy.

The adhesion protein L-selectin (CD62L) is expressed at high levels by circulating neutrophils and has a critical role in initiating their recruitment at sites of inflammation. L-selectin expression is rapidly downregulated upon neutrophil activation by various stimuli through a proteolytic process referred to as ectodomain shedding, which regulates L-selectin's binding avidity and neutrophil recruitment. In humans and mice, L-selectin shedding is primarily mediated by ADAM17 (a disintegrin and metalloproteinase 17). L-selectin expression is also rapidly downregulated by canine neutrophils upon their activation; however, the role of ADAM17 in this process has not been previously investigated. We show that a highly selective inhibitor of ADAM17, but not an inhibitor of its most closely related family member ADAM10, effectively blocked L-selectin downregulation from the surface of canine neutrophils following their activation. The ADAM17 inhibitors did not block the rapid upregulation of the CD18 integrin Mac-1 (CD11b/CD18), showing that they did not broadly impair neutrophil activation. To directly examine the expression of ADAM17, we used several anti-human ADAM17 mAbs. Many did not stain canine neutrophils; however, the ADAM17 function-blocking mAbs MEDI3622 and D1(A12) did stain and also blocked L-selectin downregulation. Taken together, our findings provide the first direct evidence that ADAM17 is a primary sheddase of canine L-selectin, which may serve as an important therapeutic target to prevent neutrophil dysfunction during conditions of excessive inflammation, such as sepsis.

Abstract Cytomegalovirus (CMV) infection alters natural killer (NK) cell phenotype and function toward a more memory-like immune state. These cells, termed adaptive NK cells, typically express CD57 and NKG2C but lack expression of the Fc receptor γ chain (Gene: FCER1G , FcRγ), PLZF, and SYK. Functionally, adaptive NK cells display enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and cytokine production. However, the mechanism behind this enhanced function is unknown. To understand what drives cytotoxicity and cytokine production in adaptive NK cells, we optimized a CRISPR/Cas9 system to ablate genes from primary human NK cells. ADCC by human NK cells is exclusively mediated by the CD16A ( FcγRIIIA ) signaling apparatus, which includes FcRγ, CD3ζ, SYK, SHP-1, ZAP-70, and the transcription factor PLZF. We ablated the genes encoding these molecules and tested subsequent ADCC and cytokine production. We found that ablating the FcRγ chain caused a modest increase in TNFα production. Ablation of PLZF did not enhance ADCC or cytokine production. Importantly, SYK kinase ablation significantly enhanced both cytotoxicity and cytokine production, while ZAP-70 kinase ablation diminished function. Ablation of the phosphatase SHP-1 resulted in mixed effects on function, with NK cells demonstrating enhanced cytotoxicity but reduced cytokine production. These results indicate that the enhanced cytotoxicity and cytokine production of CMV-induced adaptive NK cells is more likely due to the loss of SYK than the lack of FcRγ or PLZF. The lack of SYK expression may limit SHP-1-mediated inhibition of CD16A signaling, leading to enhanced cytotoxicity and cytokine production. In addition to providing mechanistic answers about CMV-induced adaptive NK cell functionality, our results indicate that NK chimeric antigen receptor (CAR) therapeutics that invoke ADCC signaling molecules (e.g., CD3ζ chain) may benefit from ablating SYK, while maintaining ZAP-70, to increase functionality.

NK cells can mediate tumor cell killing by natural cytotoxicity and by antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), an anti-tumor mechanism mediated through the IgG Fc receptor CD16A (FcγRIIIA). CD16A polymorphisms conferring increased affinity for IgG positively correlate with clinical outcomes during monoclonal antibody therapy for lymphoma, linking increased binding affinity with increased therapeutic potential via ADCC. We have previously reported on the FcγR fusion CD64/16A consisting of the extracellular region of CD64 (FcγRI), a high-affinity Fc receptor normally expressed by myeloid cells, and the transmembrane/cytoplasmic regions of CD16A, to create a highly potent and novel activating fusion receptor. Here, we evaluate the therapeutic potential of engineered induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived NK (iNK) cells expressing CD64/16A as an "off-the-shelf", antibody-armed cellular therapy product with multi-antigen targeting potential.

NK cells are being extensively studied as a cell therapy for cancer. Their effector functions are induced by the recognition of ligands on tumor cells and by various cytokines. IL-15 is broadly used to stimulate endogenous and adoptively transferred NK cells in cancer patients. These stimuli activate the membrane protease ADAM17, which then cleaves assorted receptors on the surface of NK cells as a negative feedback loop to limit their activation and function. We have shown that ADAM17 inhibition can enhance IL-15-mediated NK cell proliferation

Anti-tumor mAbs are the most widely used and characterized cancer immunotherapy agents. Despite having a significant impact on some malignancies, most cancer patients respond poorly or develop resistance to this therapy. A known mechanism of action of these therapeutic mAbs is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), which is a primarily effector function of NK cells. CD16A on human NK cells has an exclusive role in binding to tumor-bound IgG antibodies. Though CD16A is a potent activating receptor, it is a low affinity FcγR and its cell surface levels can be rapidly downregulated by a proteolytic process involving ADAM17 upon NK cell activation, which are likely to limit the efficacy of tumor-targeting therapeutic mAbs in the tumor environment. We sought to enhance NK cell binding to anti-tumor mAbs by engineering these cells with a recombinant FcγR consisting of the extracellular region of CD64, the highest affinity IgG Fc receptor expressed by leukocytes, and the transmembrane and cytoplasmic regions of CD16A. This novel recombinant FcγR (CD64/16A) was expressed in the human NK cell line NK92 and in induced pluripotent stem cells from which primary NK cells were derived. CD64/16A also lacked the ADAM17 cleavage region in CD16A and it was not rapidly downregulated in expression following NK cell activation during ADCC. CD64/16A on NK cells facilitated conjugation to antibody-treated tumor cells, ADCC, and cytokine production, demonstrating functional activity by its two components. Unlike NK cells expressing CD16A, CD64/16A captured soluble therapeutic mAbs and the modified NK cells mediated tumor cell killing. Hence, CD64/16A could potentially be used as a docking platform on engineered NK cells for therapeutic mAbs and IgG Fc chimeric proteins, allowing for switchable targeting elements, and a novel cancer cellular therapy.