While testing purines related to the non‐specific protein kinase inhibitors N 6 ‐dimethylaminopurine and N 6 ‐( 2 ‐isopentenyl)adenine as potential inhibitors of the p34 cdc2 /cyclin B kinase, we discovered a compound with high specificity, 2‐(2‐hydroxyethylamino)‐6‐benzylamino‐9‐methylpurine (olomoucine). Kinetic analysis of kinase inhibition reveals that olomoucine behaves as a competitive inhibitor for ATP and as a non‐competitive inhibitor for histone H1 (linear inhibition for both substrates). The kinase specificity of this inhibition was investigated for 35 highly purified kinases (including p34 cdk4 /cyclin D1, p40 cdk6 /cyclin D3, CAMP‐dependent and cGMP‐dependent kinases, eight protein kinase C isoforms, calmodulin‐dependent kinase II, myosin light‐chain kinase, mitogen‐activated S6 kinase, casein kinase 2, double‐stranded RNA‐activated protein kinase, AMP‐stimulated kinase, eight tyrosine kinases). Most kinases are not significantly inhibited. Only the cell‐cycle regulating p34 cdc2 /cyclin B, p33 cdk2 /cyclin A and p33 cdk2 /cyclin E kinases, the brain p33 cdk5 /p35 kinase and the ERK1/MAP‐kinase (and its starfish homologue p44 mpk ) are substantially inhibited by olomoucine (IC 50 values are 7, 7, 7, 3 and 25 μM, respectively). The cdk4/cyclin D1 and cdk6/cyclin D3 kinases are not significantly sensitive to olomoucine (IC 50 values greater than 1 mM and 150 μM, respectively). N 6 ‐( 2 ‐Isopentenyl)adenine is confirmed as a general kinase inhibitor with IC 50 , values of 50–100 μM for many kinases. The purine specificity of cyclin‐dependent kinase inhibition was investigated: among 81 purine derivatives tested, only C2, N6 and N9‐substituted purines exert a strong inhibitory effect on the p34 cdc2 /cyclin B kinase. An essentially similar sensitivity to this olomoucine family of compounds was observed for the brain‐specific cdk5/p35 kinase. Structure/activity relationship studies allow speculation on the interactions of olomoucine and its analogues with the kinase catalytic subunit. Olomoucine inhibits in vitro M‐phase‐promoting factor activity in metaphase‐arrested Xenopus egg extracts, inhibits in vitro DNA synthesis in Xenopus interphase egg extracts and inhibits the licensing factor, an essential replication factor ensuring that DNA is replicated only once in each cell cycle. Olomoucine inhibits the starfish oocyte G2/M transition in vivo. Through its unique selectivity olomoucine provides an anti‐mitotic reagent that may preferentially inhibit certain steps of the cell cycle.

Background & AimsFerroportin disease is characterized by iron overload. It has an autosomal-dominant pattern of inheritance and has been associated with mutations in the SLC40A1 gene, which encodes the cellular iron exporter ferroportin. Since the first description in 2001, about 30 mutations have been reported; the heterogeneity of ferroportin disease phenotypes has led to the hypothesis that the nature of the mutation affects the function of the protein in different ways. We studied genotypes and phenotypes of a large cohort of patients with ferroportin disease.MethodsWe studied clinical, biochemical, imaging, histologic, and genetic data from 70 affected subjects from 33 families with 19 mutations.ResultsWe found that ferroportin disease, at the time of diagnosis, has limited consequences in the absence of cofactors. Data indicated that transferrin saturation, which correlated with fibrosis and levels of alanine aminotransferase, might be a marker of disease severity. Although the study was performed in a large number of families, we observed incomplete penetrance and no correlation between genotypes and phenotypes.ConclusionsMembers of families with ferroportin disease should be screened for biochemical parameters of iron metabolism as well as genotype to detect silent mutations that might cause disease with acquired or genetic cofactors. Patients should be followed up long term to identify potential complications of the disease. Ferroportin disease is characterized by iron overload. It has an autosomal-dominant pattern of inheritance and has been associated with mutations in the SLC40A1 gene, which encodes the cellular iron exporter ferroportin. Since the first description in 2001, about 30 mutations have been reported; the heterogeneity of ferroportin disease phenotypes has led to the hypothesis that the nature of the mutation affects the function of the protein in different ways. We studied genotypes and phenotypes of a large cohort of patients with ferroportin disease. We studied clinical, biochemical, imaging, histologic, and genetic data from 70 affected subjects from 33 families with 19 mutations. We found that ferroportin disease, at the time of diagnosis, has limited consequences in the absence of cofactors. Data indicated that transferrin saturation, which correlated with fibrosis and levels of alanine aminotransferase, might be a marker of disease severity. Although the study was performed in a large number of families, we observed incomplete penetrance and no correlation between genotypes and phenotypes. Members of families with ferroportin disease should be screened for biochemical parameters of iron metabolism as well as genotype to detect silent mutations that might cause disease with acquired or genetic cofactors. Patients should be followed up long term to identify potential complications of the disease.

DMT1 is a transmembrane iron transporter involved in iron duodenal absorption and cellular iron uptake. Mutations in the human SLC11A2 gene coding DMT1 lead to microcytic anemia and hepatic iron overload, with unexpectedly low levels of plasma ferritin in the presence of iron stores.We report a patient with a similar phenotype due to two mutations in the SLC11A2 gene, the known p.Gly212Val (G212V) mutation and a novel one, p.Asn491Ser (N491S). To assess the expression of DMT1 in human liver, we studied the expression of the four DMT1 mRNA isoforms by real-time quantitative PCR in control human liver samples. We also studied the effect of G212V and N491S DMT1 mutations on RNA splicing in blood leukocytes and cellular trafficking of dsRed2-tagged-DMT1 protein in the human hepatic cell line HuH7.Our results showed that i) only the isoforms 1B-IRE and 1B-nonIRE were significantly expressed in human liver; ii) the G212V mutation did not seem to affect mRNA splicing and the N491S mutation induced a splicing alteration leading to a truncated protein, which seemed quantitatively of low relevance; and iii) the N491S mutation, in contrast to the G212V mutation, led to abnormal protein trafficking.Our data confirm the major role of DMT1 in the maintenance of iron homeostasis in humans and demonstrate that the N491S mutation, through its deleterious effect on protein trafficking, contributes together with the G212V mutation to the development of anemia and hepatic iron overload.

Ferroportin (FPN) mediates iron export from cells and this function is modulated by serum hepcidin. Mutations in the FPN gene (SLC40A1) lead to autosomal dominant iron overload diseases related either to loss or to gain of function, and usually characterized by normal or low transferrin saturation versus elevated transferrin saturation, respectively. However, for the same mutation, the phenotypic expression may vary from one patient to another. Using in vitro overexpression of wild-type or mutant FPN proteins, we characterized the functional impact of five recently identified FPN gene mutations regarding FPN localization, cell iron status, and hepcidin sensitivity. Our aim was to integrate functional results and biological findings in probands and relatives. We show that while the p.Arg371Gln (R371Q) mutation had no impact on studied parameters, the p.Trp158Leu (W158L), p.Arg88Gly (R88G), and p.Asn185Asp (N185D) mutations caused an iron export defect and were classified as loss-of-function mutations. The p.Gly204Ser (G204S) mutation induced a gain of FPN function. Functional studies are useful to determine whether or not a FPN gene mutation found in an iron overloaded patient is deleterious and to characterize its biological impact, especially when family studies are not fully informative and/or additional confounding factors may affect bio-clinical expression.

Juvenile hemochromatosis is a rare autosomal recessive disease due to variants in the Hemojuvelin (HJV) gene. Although biological features mimic HFE hemochromatosis, clinical presentation is worst with massive iron overload diagnosed during childhood. Our study describes clinical features and results of genetic testing for a group of patients initially referred for a hepcidino-deficiency syndrome and for whom HJV hemochromatosis was finally diagnosed. 662 patients with iron overload and high serum transferrin saturation were tested, and five genes (HFE, HJV, HAMP, TFR2, SLC40A1) were sequenced. Among our cohort, ten unrelated patients were diagnosed with HJV hemochromatosis. Genetic testing revealed five previously published and five undescribed variants: p.Arg41Pro, p.His180Arg, p.Lys299Glu, p.Cys361Arg and p.Ala384Val. Surprisingly, this study revealed a late age of onset in some patients, contrasting with the commonly accepted definition of “juvenile” hemochromatosis. Five of our patients were 30 years old or older, including two very late discoveries. Biological features and severity of iron overload were similar in younger and older patients. Our study brings new insight on HJV hemochromatosis showing that mild phenotype and late onset are possible. Genetic testing for HJV variants should thus be performed for all patients displaying a non-p.Cys282Tyr homozygous HFE hemochromatosis with hepcidin deficiency phenotype.

Genetic iron overload has long been confined to the picture of classical hemochromatosis related to the HFE C282Y mutation (type 1 hemochromatosis). C282Y homozygosity affects approximately three people out of 1000 of the Caucasian population, representing one of the most frequent genetic predispositions. It has, however, rapidly become clear that the HFE C282Y mutation is not the sole culprit in genetic iron overload. Several novel mutations in HFE and other genes have been discovered and related to various entities, which are now known as types 2, 3 and 4 hemochromatosis. These diseases are far less frequent than the classical type 1 hemochromatosis but, by contrast, are not limited to the Caucasian population. Molecular diagnosis obviously plays a key role in the diagnostic strategy. In the future, it will undoubtedly enable not only identification of new diagnostic markers, but also provide potential molecular targets for pathophysiologically based innovative therapeutic approaches.

Ferroportin disease is a rare genetic iron overload disorder which may be underdiagnosed, with recent data suggesting it occurs at a higher prevalence than suspected. Costs and the lack of defined criteria to prompt genetic testing preclude large-scale molecular screening. Hence, we aimed to develop a readily available scoring system to promote and enhance ferroportin disease screening.Our derivation cohort included probands tested for ferroportin disease from 2008 to 2016 in our rare disease network. Data were prospectively recorded. Univariate and multivariate logistic regression were used to determine significant criteria, and odds ratios were used to build a weighted score. A cut-off value was defined using a ROC curve with a predefined aim of 90% sensitivity. An independent cohort was used for cross validation.Our derivation cohort included 1,306 patients. Mean age was 55±14 years, ferritin 1,351±1,357 μg/L, and liver iron concentration (LIC) 166±77 μmol/g. Pathogenic variants (n = 32) were identified in 71 patients. In multivariate analysis: female sex, younger age, higher ferritin, higher LIC and the absence of hypertension or diabetes were significantly associated with the diagnosis of ferroportin disease (AUROC in whole derivation cohort 0.83 [0.78-0.88]). The weighted score was based on sex, age, the presence of hypertension or diabetes, ferritin level and LIC. An AUROC of 0.83 (0.77-0.88) was obtained in the derivation cohort without missing values. Using 9.5 as a cut-off, sensitivity was 93.6 (91.7-98.3) %, specificity 49.5 (45.5-53.6) %, positive likelihood ratio 1.8 (1.6-2.0) and negative likelihood ratio 0.17 (0.04-0.37).We describe a readily available score with simple criteria and good diagnostic performance that could be used to screen patients for ferroportin disease in routine clinical practice.Increased iron burden associated with metabolic syndrome is a very common condition. Ferroportin disease is a dominant genetic iron overload disorder whose prevalence is higher than initially thought. They can be difficult to distinguish from each other, but the limited availability of genetic testing and the lack of definitive guidelines prevent adequate screening. We herein describe a simple and definitive clinical score to help clinicians decide whether to perform genetic testing.

Le fer est indispensable à la vie cellulaire car il intervient dans l’activité biologique de nombreuses protéines auxquelles il est associé. Cependant, un excès de fer est toxique, notamment par la production excessive d’espèces réactives de l’oxygène qu’il peut générer. Le métabolisme du fer doit donc être strictement contrôlé pour éviter l’apparition de situations pathologiques. Le contrôle du métabolisme du fer s’exerce d’abord au niveau systémique, notamment par l’intermédiaire du couple hepcidine, peptide secrété par l’hépatocyte, ferroportine, protéine transmembranaire exportant le fer des macrophages et entérocytes vers le plasma. L’hepcidine contrôle la libération de fer vers le plasma et donc sa disponibilité. Des niveaux anormaux d’hepcidine entraînent des situations de surcharge en fer ou de carences en fer. Le deuxième niveau de contrôle du métabolisme du fer s’exerce au sein des cellules grâce au système iron regulatoty protein/iron responsive element. Celui-ci coordonne les niveaux d’entrée du fer lié à la transferrine et la capacité de stockage du fer dans la cellule, permettant d’éviter des phénomènes délétères. La compréhension des mécanismes contrôlant le métabolisme du fer ouvre la porte au développement de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques. Pour ces derniers, il sera nécessaire d’intégrer les différents effets bénéfiques que pourraient avoir certaines anomalies du métabolisme du fer, notamment au cours de l’inflammation. Iron is required for the biological activities of a large number of proteins and is therefore needed for cell life. However, iron in excess is toxic, mainly due to its ability to promote the appearance of oxygen reactive species. Therefore, iron metabolism must be strictly controlled. This control takes, firstly, place at the systemic level through the hepcidin-ferroportin couple. Hepcidin, a peptide secreted by hepatocytes, interacts with ferroportin which allows iron egress from enterocytes and macrophages, the main providers of iron for plasma. Therefore, hepcidin controls iron leakage and plasma iron bioavailability. Abnormal levels of hepcidin are involved in the development either or iron overload diseases or iron deficiency. Iron metabolism control takes place, secondly, within the cells, thanks to the iron regulatoty protein/iron responsive element system which coordinates levels of transferrin iron uptake and iron storage capacity, in order to avoid deleterious situations for cells. Understanding the mechanisms which control iron metabolism paves the road for the development of new diagnostic and therapeutic tools. For the later, it will be necessary to integrate benefits that could be associated with abnormalities of iron metabolism occurring during inflammation.

Le fer intervient dans de nombreuses fonctions biologiques et est donc nécessaire. Cependant, en excès, il est toxique. Le maintien d’un niveau adéquat de fer ainsi que sa bonne répartition dans l’organisme et dans les cellules sont possibles grâce à des mécanismes de régulation systémiques et cellulaires. Le contrôle systémique du métabolisme du fer fait intervenir l’hepcidine, peptide secrété par l’hépatocyte, et la ferroportine, protéine membranaire exportant le fer des macrophages et entérocytes vers le plasma. L’hepcidine interagit avec la ferroportine et provoque sa dégradation, contrôlant ainsi le niveau de fer plasmatique. Des niveaux anormaux d’hepcidine sont impliqués dans l’apparition de surcharges ou de carences en fer. La compréhension des mécanismes contrôlant les niveaux d’hepcidine est donc un enjeu majeur. Le contrôle cellulaire du fer fait intervenir le système iron regulatory protein/iron responsive element qui permet d’adapter l’entrée du fer lié à la transferrine dans la cellule et la capacité de stockage cellulaire du fer au niveau de fer intracellulaire, permettant ainsi d’éviter l’apparition de situations délétères pour la cellule. Les nouvelles connaissances acquises sur le métabolisme du fer permettent de mieux comprendre les mécanismes en cause dans les pathologies du métabolisme du fer. De nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques, issues de ces connaissances, permettront d’améliorer la prise en charge des patients. Iron is involved in many biological functions and is therefore required for cell life. However, when present in excess, it is toxic. Maintenance of adequate levels of iron as well as its proper distribution in the body and cells are possible through systemic and cellular mechanisms. Systemic control of iron metabolism involves hepcidin, a peptide secreted by hepatocytes, and ferroportin, the iron exporter from macrophages and enterocytes toward plasma. Hepcidin interacts with ferroportin and causes its degradation, thus controlling the level of plasma iron. Abnormal levels of hepcidin are involved in the onset of iron overload or deficiency. Understanding the mechanisms controlling hepcidin levels is therefore a major issue. Control of cellular iron involves the iron regulatory protein/iron responsive element system that regulates transferrin-iron uptake by cells as well as the iron storage capacity, thus avoiding cell damage. New knowledge on iron metabolism permits a better understanding of the mechanisms involved in iron metabolism disorders. From this knowledge, new diagnostic and therapeutic strategies will improve the patients management.

L’hemojuveline (HJV) est une proteine qui joue un role majeur dans le controle de l’expression de l’hepcidine et donc dans le maintien de l’homeostasie du fer par l’impact que l’hepcidine exerce sur le controle de la biodisponibilite plasmatique du fer. Exprimee sur la membrane de l’hepatocyte, elle joue le role de corecepteur des bone morphogenetic proteins (BMP) et participe ainsi a la transmission du signal ne de l’interaction entre les BMP et leurs recepteurs. Cela entraine une expression de l’hepcidine par les hepatocytes au travers de la voie de transduction du signal BMP/SMAD et des BMP-responsive elements localises dans le promoteur du gene codant l’hepcidine. Une forme soluble de l’HJV, produite par les hepatocytes mais aussi par le muscle strie, second site d’expression de l’HJV, pourrait moduler l’efficacite biologique de la forme membranaire, par competition avec le recepteur aux BMP. Des mutations homozygotes du gene codant l’HJV sont a l’origine de surcharges en fer hemochromatosiques severes dites juveniles, car survenant le plus souvent avant 30 ans, liees a une expression anormalement basse de l’hepcidine. Des cas de digenisme, associant une mutation heterozygote du gene HJV a une mutation dans un autre gene implique dans le developpement de surcharges en fer, peuvent etre retrouves. A l’inverse, des anomalies de maturation de la proteine HJV liees a des mutations du gene TMPRSS6 aboutissent a une facilitation de l’expression membranaire de l’HJV, ce qui entraine une hyperactivite de la voie BMP/SMAD et donc de l’expression de l’hepcidine. Il en resulte en retour une baisse des parametres seriques du fer et une anemie de type inflammatoire resistante a la supplementation en fer.